爬行类动物血液多细胞单步染色的单染料染色试剂和方法与流程

本技术属爬行类动物血液细胞明场识别用的染色，尤其涉及一种在细胞悬浮液状态下进行爬行类动物血液单步快速染色的染色试剂和方法，能快速将爬行类动物血液中的多种细胞实现同时染色，以便能进行爬行类动物血液中不同类型细胞的识别和计数。

背景技术：

1、不同种类的动物处于进化的不同阶段，对不同进化阶段的动物类型，其外周血液中的血液细胞类型、形态和数量都存在不同的差异。如，爬行类动物血液中的血液细胞种类和形态和哺乳类动物血液中血液细胞种类是有差别的。但无论是那种动物，血液细胞中都存在红细胞和白细胞。若要对其中的红细胞和白细胞进行识别和区分，还是需要进行染色处理。不同物种的细胞具体类型也可能约有差异，其中包括了中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞中的部分类型。

2、对非哺乳类动物的血液细胞染色，通常采用血液涂片的形式，血涂片操作复杂，需要在载玻片滴加适量的血液后，使用盖玻片呈30-45度角将血液推开，然后再进行风干操作。若推片操作不熟练，容易导致单层区细胞不均匀，影响后续染色操作，难以对细胞形态进行评估；另为了实现不同类型细胞的染色区分，通常涉及了多种染料来组成染色剂，物料和使用成本高，且难以维持鲜活细胞的形态。现有技术中，还未见有在悬浮液状态下对爬行动物细胞进行染色用于细胞形态学分析的染色试剂。

3、在细胞悬浮液状态下进行细胞染色，挑战之一是，悬浮液中的离子浓度调节。以细胞的细胞膜当作半透膜，若细胞悬浮液的离子浓度处于高渗状态，细胞会萎缩难以保持原来的形态；当悬浮液中的离子浓度处于较为低渗状态下，细胞很容易被胀大，严重时甚至会破裂，最终无法维持细胞形态，使得染色效果无法保持到细胞观察完成；当悬浮液中的离子浓度处于等渗状态时，即外部的水不会进入细胞内部，此时比较容易维持细胞的形态；但等渗状态下染色物质也不容易进入细胞核内部进行核物质的染色；染色的时间需要更长。但是为了维持细胞形态便于观察，一般在悬浮液状态下，通常采用等渗的染色试剂进行染色。

4、名词解释：

5、核酸物质是指，细胞内存在的具有遗传特性的物质即dna或rna或及其片段。

6、edta盐是指，乙二胺四乙酸盐；乙二胺四乙酸盐会与血液中的钙例子结合形成配位化合物，从而阻止血凝。edta盐常规用作血液抗凝剂。

7、渗透压：隔以半透膜，一方为溶酶的水，另一方为溶液，水通过半透膜向溶液一方渗透；为阻止水的移动在溶液侧所加的压力称为渗透压。水的运动之所以停止，是该压力与通过膜的水的化学势能相等所致。渗透压以渗透压摩尔浓度作为单位，该单位通常以每千克溶剂中溶质的毫渗透压座尔来表示渗透压。

8、本技术中的部分物质的cas编号如下：

9、 物质名称 cas编号 磷酸氢二钠 10039-32-4 磷酸二氢钾 7778-77-0 nacl 2647-14-5 <![cdata[edta·k₂]]> 2001-94-7 <![cdata[edta·k₃]]> 17572-97-3 <![cdata[edta·na₂]]> 6381-92-6 新亚甲蓝 229-516-6 水 7732-18-5 商品化37％甲醛溶液 50-00-0 商品化50％戊二醛溶液 111-30-8

10、(casregistrynumber或称casnumber,casrn,cas#)，又称cas登录号或cas登记号码，是某种物质(化合物、高分子材料、生物序列(biologicalsequences)、混合物或合金)的唯一的数字识别号码。

11、本技术中的水，是纯化水。纯化水是指符合《中国药典(2015版)》纯化水标准的水，其主要参数为：使用离线电导率仪检测，25℃温度下，标示装量不大于10ml(毫升)时，电导率不大于25μs/cm(微西门子每厘米)的水。

12、《gb/t6686-2006染料分类》中将碱性染料归入阳离子染料中，“碱性染料：

13、旧称碱性染料的品种，是在水溶液中能解离生成阳离子色素的染料；阳离子染料：是一类在水溶液中能解离生成阳离子色素的染料，该类染料可在弱酸性染浴中对含有阴离子染席的物质进行染色。

技术实现思路

1、为了提供一种高效实现多种不同类型细胞同时单步快染，本发明提出了一种爬行类动物血液多细胞单步染色的单染料染色试剂和方法及制备方法。

2、本技术解决上述技术问题的技术方案是一种爬行类动物血液多细胞单步染色的单染料染色试剂，包括染色剂a10、渗透缓冲盐a30、促染稳定剂b10和水；染色剂a10为新亚甲蓝；新亚甲蓝浓度为0.3×10-4～3.0×10-4g/ml；渗透缓冲盐a30，用于提供相对血液的低渗透压，渗透压范围是170mosmol/kg～210mosmol/kg；同时，渗透缓冲盐a30用于提供ph值为7-8的弱碱性环境；促染稳定剂b10包括含醛类物质，含醛类物质用于同细胞膜表面的蛋白质发生化学交联，染色剂a10进入细胞的速率加快。

3、所述爬行类动物血液多细胞单步染色的单染料染色试剂，用于龟血液细胞染色，ph值为7.1至7.5。

4、所述爬行类动物血液多细胞单步染色的单染料染色试剂，渗透缓冲盐a30包括磷酸氢二钠和磷酸二氢钾。

5、所述爬行类动物血液多细胞单步染色的单染料染色试剂，用于龟血液细胞染色，磷酸氢二钠浓度为4.3×10-2～5.7×10-2mol/l，磷酸二氢钾浓度为9.5×10-3～2.5×10-2mol/l；ph值为7.1～7.5。

6、所述爬行类动物血液多细胞单步染色的单染料染色试剂，所述促染稳定剂b10包括甲醛和戊二醛。

7、所述爬行类动物血液多细胞单步染色的单染料染色试剂，用于龟血液细胞染色，甲醛浓度为0.9×10-2mol/l～1.3×10-2mol/l；戊二醛浓度为3.6×10-3mol/l～4.8×10-3mol/l。

8、所述爬行类动物血液多细胞单步染色的单染料染色试剂，渗透缓冲盐a30还包括nacl，nacl的浓度范围是4.67×10-3mol/l～1.98×10-2mol/l。

9、所述爬行类动物血液多细胞单步染色的单染料染色试剂，每500ml染色试剂中包括0.5ml的proclean950溶液即防腐剂。

10、本技术解决上述技术问题的技术方案还可以是一种爬行类动物血液细胞单步快速染色方法，使用上述的爬行类动物血液多细胞单步染色的单染料染色试剂；包括将标准血液样本与上述爬行类动物血液多细胞单步染色的单染料染色试剂混合m秒的步骤；混合的时间m范围是180秒以上；混合的温度条件是18摄氏度至45摄氏度。

11、上述技术方案的技术效果之一：通过巧妙设计的低渗环境，配方中单一的染料组分能借助细胞内外的离子浓度差，快速穿越细胞膜进入细胞内，使染料容易进入细胞膜内部与细胞内的核物质结合，完成细胞核物质的快速染色；采用一次试剂加入就能快速完成多种不同类型的细胞的染色，实现单染料染色试剂的单步染色。

12、上述技术方案的技术效果之二：促染稳定剂b10中的含醛类物质，会与细胞膜表面的蛋白质发生反应，形成胶体聚层，从而稳定和固定细胞形态，且在细胞膜表面形成固定的染料通道，使细胞被固定后，染料更容易穿透细胞膜，实现单步快速染色。

13、上述技术方案的技术效果之三：通过巧妙设计的低渗环境和ph值为7-8的弱碱性环境的配合，使得多种不同类型细胞的细胞核以及核酸物质更容易呈现出带负电的特性，特别容易和带正电的酸性或碱性染料结合，因此只采用一种带正电的酸性或碱性染料就能将不同类型的细胞同时进行染色，即有核红细胞以及白细胞中的中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞在该环境状态下都能被染色充分，达到一种足以支持明场显微镜可以识别出多种不同类型细胞的程度。

14、上述技术方案的技术效果之四：染色剂a10中带正电的染料何以与细胞中带负电的磷酸基团结合，基于电特性的结合，使染料和细胞核内带负电的核酸物质基团结合更稳定，使不同酸碱特性的细胞核物质都能完成染色；且确保染色效果能保持的时间更久。

15、上述技术方案的技术效果之五：巧妙设计的低渗环境，使得渗透压处于一个非常微妙的平衡状态，使染色过程中，会在细胞形态维持的状态下略微使细胞胀大，在该渗透压的范围内，细胞略微涨大后还增加了细胞核核细胞膜中其他细胞质的区分，更有利于不同细胞类型的识别和区分。

16、上述技术方案的技术效果之六：染色剂a10中新亚甲蓝带正电，进入细胞核之后，让磷酸基团间的负电荷减少，发生凝缩；凝缩后更能显现出细胞内部结构。