一种活血化瘀、行气止痛药物制剂指纹图谱的测定方法与流程

本发明涉及中药质量检测方法，具体涉及一种活血化瘀、行气止痛药物制剂指纹图谱的测定方法。

背景技术：

1、本方案的活血化瘀、行气止痛药物制剂，其原料由丹参、葛根、三七、山楂、木香组成，其制备方法如下：取三七、木香及部分山楂粉碎成细粉，剩余的山楂、葛根加入60％乙醇温浸30分钟，回流提取二次，合并醇提液，回收乙醇，备用；丹参加水煎煮二次，合并煎液，滤过，滤液与上述备用液合并，混匀，浓缩至适量，加入上述细粉制成颗粒、胶囊、丸剂、片剂等。该制剂具有活血化瘀，行气止痛。用于因气滞血瘀引起的胸中憋闷、疼痛、头晕、头痛、颈项疼痛等证。现代多用于冠心病、心绞痛、心脏疾患引起的心律失常(早博)有上述表现者。其制剂中标志性成份包括多种，哪些标志性成分适合用于制剂质量监控，如何能够保证在检测过程中各种标志性成分能够被有效检出，这是实现制剂质量监控所需要首先解决的问题。并且，制剂中指标性成份各物质的溶解性能、紫外吸收波长和在色谱柱中的分离特性存在差异，很难找到一种稳定可靠的方法鉴定该制剂中标志性成分，也即很难评价该品制剂中标志性成分的质量稳定性。

2、为了更有效且准确地评估药物质量，亟需开发出一种新型的指纹图谱测定方法，能否方便、快速且准确地检测出制剂中各种标志性成分的含量。

技术实现思路

1、本发明意在提供一种活血化瘀、行气止痛药物制剂指纹图谱的测定方法，以解决现有技术的检测方法操作复杂且准确性有限的技术问题。

2、为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种活血化瘀、行气止痛药物制剂指纹图谱的测定方法，包括以下依次进行的步骤：

4、s1：从药物制剂中提取获得供试品；

5、s2：使用高效液相色谱检测所述供试品，获得指纹图谱；

6、s3：将所述指纹图谱与标准指纹图谱进行比对，进而评价药物制剂质量；

7、所述标准指纹图谱包括如下特征峰：代表丹参素钠的特征色谱峰1、代表原儿茶醛的特征色谱峰2、代表3'-羟基葛根素的特征色谱峰3、代表葛根素的特征色谱峰4、代表3'-甲氧基葛根素的特征色谱峰5、代表葛根素-7-木糖苷的特征色谱峰6、代表大豆苷的特征色谱峰7、代表丹酚酸b的特征色谱峰8。

8、本发明还提供了一种活血化瘀、行气止痛药物制剂指纹图谱的测定方法在药物标志性成分评价中的应用。

9、本方案的原理及有益效果在于：

10、在基于液相色谱的中成药指纹图谱分析中，由于药物成分复杂，通常需要在同一个分析周期中，分离出多种标志性成分，以表征该中成药功效成分的含量情况。在液相色谱中，对组分复杂的样品则采用梯度洗脱的方法。梯度洗脱又称为梯度淋洗或程序洗脱，在同一个分析周期中，按一定程度不断改变流动相的浓度配比，从而可以使一个复杂样品中的性质差异较大的组分能按各自特性达到良好的分离目的。针对于本方案的活血化瘀、行气止痛药物制剂，其功效成分较为复杂，并且用于对其表征的标志性成分较多，包括：丹参素钠、原儿茶醛、3'-羟基葛根素、葛根素、3'-甲氧基葛根素、葛根素-7-木糖苷、大豆苷、丹酚酸b等。发明人前期研究表明对上述几种标志性成分的联合鉴定，可以保证全面且有效的药物质量评价。由于本制剂成分复杂，需要分离的标志性成分较多，现有技术一般采用梯度洗脱的方式，来构建本方案的活血化瘀、行气止痛药物制剂的指纹图谱。但是，使用梯度洗脱的方式存在以下的缺点：(1)梯度洗脱对仪器的配置要求较高，通常需要配置四元泵或者二元泵；(2)在每次运行样品之间，需要设置一定的平衡时间，来让系统中流动相的比例到达初始流动相比例；(3)由于方法设置复杂，例如影响分离的有初始流动相比例、流动相的梯度变化、结束流动相比例、柱温箱温度等，所以方法的开发和优化会较为复杂。

11、为了提升分析效率，降低运行成本，发明人尝试了将梯度洗脱的方式改为等度洗脱。用等度洗脱进行色谱分离时，由不同溶剂构成的流动相的组成，如流动相的极性、离子强度、ph值等，在分离的全过程中皆保持不变。由于等度洗脱方法运行时，流动相的比例不发生变化，所以它对仪器的要求不高，只需要一个单元泵就可以运行。并且由于等度洗脱每次运行时的流动相比例相同，所以相同方法运行多个样品时，样品之间不需要设置平衡时间来让系统恢复到所需的流动相比例。虽然等度洗脱有上述的优点，但是，由于本制剂的用于制备指纹图谱的标志性成分太多，如果用等度洗脱，会带来如下不良后果：分析时间较长，部分标志性成分的峰形不佳(欠尖锐)，8种标志性成分难以全部充分分析(特征峰之间分离度较差)。为了探索如何将等度洗脱应用到本方案的制剂指纹图谱建立当中，发明人进行了大量尝试，发现本制剂指纹图谱的制备过程中的流动相组成以及制剂提取方式，对获得理想的指纹图谱有非常关键的影响。

12、基于上述研究，本技术方案建立了一种活血化瘀、行气止痛药物制剂指纹图谱的测定方法，可以在简化操作流程以及降低设备成本的情况下，快速且准确地获得用于对产品进行质量鉴定的指纹图谱，对制剂的标志性成分进行定量或者定性分析。

13、发明人通过对历史生产批次的制剂进行了指纹图谱追踪分析，发现丹参素钠、原儿茶醛、3'-羟基葛根素、葛根素、3'-甲氧基葛根素、葛根素-7-木糖苷、大豆苷、丹酚酸b这八种标志性成分，在各批次中均具有一定的稳定性，可以用作评价制剂质量的指标。本方案的标准指纹图谱包括以上8种标志性成分的特征峰，在评价待测批次质量时，只需要将待测批次的指纹图谱与标准指纹图谱进行比对，即可。

14、进一步，在s1中，所述供试品由如下方法制备：使用n,n-二甲基甲酰胺作为提取溶剂，对药物制剂进行超声辅助提取，获得供试品。

15、优选的技术参数包括：超声功率为250w，频率为40khz，时间为30分钟；药物制剂和n,n-二甲基甲酰胺的用量比为0.5g：50ml。

16、采用上述技术方案，使用n,n-二甲基甲酰胺为溶剂提取活血化瘀、行气止痛药物制剂样本中的指标性成分，可将指标性成分充分提取，并用于后续的液相色谱检测过程。活血化瘀、行气止痛药物制剂中指标性成份较多(丹参素钠、原儿茶醛、3'-羟基葛根素、葛根素、3'-甲氧基葛根素、葛根素-7-木糖苷、大豆苷、丹酚酸b)，各物质的溶解性能存在差异，很难找到一种溶剂能将所有指标性物质溶解并提取出来。发明人尝试过多种溶剂，最后发现只有n,n-二甲基甲酰胺才能将药物制剂中的8种指标性成分充分提取，并且能够在后续的液相色谱检测中获得特征峰分离清晰且符合要求的指纹图谱。n,n-二甲基甲酰胺对本方案的指纹图谱鉴别具有较好的适配性，换成其他溶剂则不能将各种指标性成份同时且充分地提取。

17、进一步，在s2中，所述高效液相色谱的流动相由乙腈、四氢呋喃和醋酸溶液组成。

18、进一步，在s2中，乙腈、四氢呋喃和醋酸溶液的体积比为40：40：20。优选醋酸溶液溶质的质量百分数为0.4％。

19、进一步，在s2中，高效液相色谱的色谱柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶，填料粒径为3.5-5.0μm。优选的高效液相色谱的色谱柱的规格为：直径4.6mm、长度7.5-25cm，长度优选7.5cm；填料粒径优选为3.5μm。

20、采用上述检测方法，可获得特征峰峰型尖锐、理论塔板数高、分离度好的标准指纹图谱、待测样品指纹图谱和对照品指纹图谱。

21、进一步，在s2中，高效液相色谱检测的检测波长为287nm，柱温为40℃，流速为1ml/min，进样量为10～20μl。

22、进一步，在s3中，特征色谱峰1的保留时间为5.5～5.8min、特征色谱峰2的保留时间为11.4～11.7min、特征色谱峰3的保留时间为17.1～17.4min、特征色谱峰4的保留时间为24.4～24.7min、特征色谱峰5的保留时间为27.7～27.9min、特征色谱峰6的保留时间为28.5～29.0min、特征色谱峰7的保留时间为29.1～29.5min、特征色谱峰8的保留时间为41.5～41.9min。

23、更具体地，在本技术方案中，所述标准指纹图谱的总长度为50min；峰1的特征色谱峰的平均保留时间为5.7min，平均峰面积为50360；峰2的特征色谱峰的平均保留时间为11.6min，平均峰面积为83769；峰3的特征色谱峰的平均保留时间为17.1min，平均峰面积为550224；峰4的特征色谱峰的平均保留时间为24.5min，平均峰面积为1350121；峰5的特征色谱峰的平均保留时间为27.7min，平均峰面积为371365；峰6的特征色谱峰的平均保留时间为28.6min，平均峰面积为219346；峰7的特征色谱峰的平均保留时间为29.3min，平均峰面积为364074；峰8的特征色谱峰的平均保留时间为41.6min，平均峰面积为367234。

24、进一步，以重量份计，所述药物制剂的原料包括：丹参10-20份、葛根10-20份、三七7-12份、山楂10-20份、木香7-12份。

25、进一步，所述药物制剂的剂型为胶囊、片剂、颗粒剂、口服液和丸剂中的任意一种。

26、本方案的药物制剂包括多种剂型形式，例如：胶囊、片剂、颗粒、丸剂和口服液等。本方案建立的指纹图谱和鉴别方法均可以应用于上述胶囊、片剂、颗粒、丸剂和口服液等制剂的鉴定。

27、综上所述，本技术方案的有益效果总结如下：

28、(1)本发明提供的液相色谱指纹鉴别图谱测定方法，所获得的一种活血化瘀、行气止痛药物制剂组合物的指标性成分鉴别指纹图谱能够反应药物中的指标性成分，这些成分分别来自丹参素钠、原儿茶醛、3'-羟基葛根素、葛根素、3'-甲氧基葛根素、葛根素-7-木糖苷、大豆苷、丹酚酸b。

29、(2)本发明提供的液相色谱指纹鉴别图谱测定方法的专属性、精密度、重复性、溶液稳定性和耐用性好。

30、(3)本发明提供的液相色谱指纹鉴别图谱测定方法能够控制产品的内在质量，提高质量控制水平，更能保证产品的质量。