一种染色试剂以及获得具节纤小丝状大型海藻显微结构的方法与流程

本发明涉及生物体样品制片方法领域，尤其是一种染色试剂以及获得具节纤小丝状大型海藻显微结构的方法。

背景技术：

1、显微结构研究，是揭示生命现象和过程的必须手段，从荷兰科学家虎克发明显微镜以来已经有300多年，取得了许多进步，但该领域的研究往往受到样品处理过程中制片技术的好坏所影响。

2、具节纤小丝状大型海藻，是海洋中的大型低等植物，主要为仙菜目ceramiales中的物种，其包括仙菜属ceramiun、纵胞藻属centroceras、多管藻属polysiphonia、新管藻属neosiphonia、爬管藻属herposiphonia等属物种。藻体横切面观、四分孢子囊的起源、假根的起源、皮层的发育等显微结构特征是对这些属种进行准确物种鉴定、分类和生命活动等研究的重要特征。然而，这些属种藻体过于纤细，其宽度多在几十个微米至几毫米之间，要获得其清晰的各种显微结构特征难度很大。过去该领域的学者主要是用石蜡切片来获得其显微结构特征。但是这存在明显的不足：1)石蜡切片需要通过固定—洗涤—脱水—透明—浸蜡—包埋—切片—展片—烤片多道程序，其操作复杂，费时费力；2)石蜡切片需要脱水机、包埋机、切片机等仪器，而且在以上的操作程序中需要各种试剂，投入成本高；3)有些藻体其宽度仅有四十几微米，非常细，纵使石蜡切片也很难切出理想的显微结构；4)石蜡切片所获得的显微结构为一个个独立的横切面，不具备完整性，不能直观体现一段藻体显微结构特征的连续变化；5)石蜡切片不能获得皮层结构特征。也有学者采用染色制片的方法，但往往只能获得皮层结构，由于配方的缺陷，无法进一步获得更加清晰完整的关键显微结构，且无法通过染色来凸显结构中重要特征，如现有技术中，海藻结构中的纹孔连接的节点和胞间连丝都无法通过染色方法观察到。

3、如何能快速获得具节纤小丝状大型海藻显微结构，显然是一个科学难题。

技术实现思路

1、本发明所要解决的第一个技术问题是：

2、提供一种染色试剂。

3、本发明所要解决的第二个技术问题是：

4、提供一种所述染色试剂的制备方法。

5、为了解决所述第一个技术问题，本发明采用的技术方案为：

6、一种染色试剂，包括以下组分：

7、对氯间二甲苯酚；

8、酸性试剂；

9、洋红试剂；

10、溶剂；

11、其中，对氯间二甲苯酚、酸性试剂和溶剂的体积比为5：(45-80)：(55-80)；

12、所述酸性试剂包括冰醋酸。

13、根据本发明的实施方式，所述技术方案中的一个技术方案至少具有如下优点或有益效果之一：

14、1.本发明的染色试剂，一方面通过染色试剂中的洋红试剂对样品进行染色，凸显结构中某些重要特征，如纹孔连接的节点等，另一方面也因具节纤小丝状大型海藻其皮层细胞与围轴细胞之间、围轴细胞相互之间、围轴细胞与轴细胞之间存在胞间粘质及胞间连丝，纹孔连接等各种连接，存在致密性，所以需要先利用对氯间二甲苯酚及醋酸的腐蚀性来解离皮层细胞与围轴细胞之间、围轴细胞相互之间、围轴细胞与轴细胞之间粘质及其连接，然后通过把握混合试剂中对氯间二甲苯酚、酸性试剂和溶剂的体积比，保留皮层内部细胞之间的连接。

15、2.本发明的染色试剂，通过冰醋酸与洋红试剂的组合，可染色出凸显结构中某些重要特征，如纹孔连接的节点、胞间连丝等，这些特征有利于更清晰的展示皮层发育和四分孢子囊的发育。此外，对氯间二甲苯酚的使用，相对于现有染色试剂中的苯酚，氯间二甲苯酚更适用于具节纤小丝状大型海藻，经过氯间二甲苯酚处理后，可以进一步获得具节纤小丝状大型海藻的假根发育方式、四分孢子囊发育方式、围轴细胞数目及其连续变化过程、皮层发育过程等各种清晰完整的关键显微结构。

16、3.本发明的染色试剂，能够促进细胞质壁分离，并且能够进一步使得胞间连丝变得很清晰。

17、根据本发明的一种实施方式，所述酸性试剂还包括乳酸。通过在酸性试剂中，再加入包括乳酸在内的酸性试剂，能够促进酸性试剂的腐蚀效果。

18、根据本发明的一种实施方式，对氯间二甲苯酚、酸性试剂和溶剂的体积比为5：(45-50)：(55-60)。

19、根据本发明的一种实施方式，所述洋红试剂的添加量为过量。

20、为了解决所述第二个技术问题，本发明采用的技术方案为：

21、一种获得具节纤小丝状大型海藻显微结构的方法，包括以下步骤：

22、s1配置所述的染色试剂；

23、s2混合海藻样品与染色试剂，得到染色后的样品；

24、s3将海藻样品以节为单位进行分离，每一节即为一个样品的横切面；

25、s4挑断步骤s3中分离后海藻的环节，将断节平展开来，通过显微镜观察显微结构。

26、根据本发明的实施方式，所述技术方案中的一个技术方案至少具有如下优点或有益效果之一：

27、1.本发明的方法，制片速度快，花费极少，经济适用，有利于工业化生产。

28、2.本发明的方法，染色效果好，能获得各种完整清晰的显微结构，且不易褪色。染色后得到的样品，由于染色试剂组分含有对氯间二甲苯酚和酸性试剂，使得样品自身也具有杀菌防腐作用，能较长时间保存。

29、3.通过本发明的方法，不仅可获得具节纤小丝状大型海藻的各种清晰特征的显微结构，而且还能直观体现一段藻体显微结构特征的连续变化，在海藻的形态学、解剖学、发育学及进化研究方面有重要的应用价值。

30、根据本发明的一种实施方式，步骤s1中，配置所述染色试剂，包括以下步骤：混合酸性试剂于溶剂中，得到混合液，将所述混合液煮沸至沸点，加入过量的洋红试剂，经冷却、过滤，向滤液中加入对氯间二甲苯酚，得到所述染色试剂。

31、根据本发明的一种实施方式，步骤s2中，于密闭槽中混合样品与染色试剂，混合的时间为5-6h。混合的时间，以腐蚀后的样品是否能被针灸针轻松挑开为准。在本发明中，通过把握染色试剂中用于腐蚀的成分含量及腐蚀所用的时间，来保留皮层内部细胞之间的连接，以利于后续操作，如挑开藻体、整块皮层或者获得横切面等。

32、根据本发明的一种实施方式，步骤s2中，还包括以下步骤：用毛刷清洁海藻样品。

33、根据本发明的一种实施方式，步骤s3中，将海藻样品以节为单位进行分离，所使用的分离工具包括针灸针。

34、根据本发明的一种实施方式，步骤s3中，还包括以下步骤：先以溶剂洗净海藻样品中多余的染色试剂，再加溶剂使海藻样品悬浮。

35、根据本发明的一种实施方式，步骤s3中得到的横切面，无需盖片，可直接在4x和10x物镜下选取特征拍照。

36、根据本发明的一种实施方式，步骤s4中，将断节平展开来，包括以下步骤：将断节平铺于载玻片上，盖上盖玻片。

37、根据本发明的实施方式，步骤s4中，将断节平展开来，得到皮层结构。

38、根据本发明的一种实施方式，将断节平铺于载玻片上，盖上盖玻片之后，还包括添加保湿防腐剂和封片的步骤。

39、本发明的另一个方面，还涉及所述染色试剂在形态学或解剖学或发育学或进化学中的应用。包括如上述第1方面实施例所述的染色试剂。由于该应用采用了上述染色试剂的全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果。

40、本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。