用于测量荧光偶极子三维取向的显微成像系统及方法

本发明属于光学显微成像，特别涉及偏振荧光显微镜领域，尤其涉及一种用于测量荧光偶极子三维取向的显微成像系统及方法。

背景技术：

1、有机荧光染料和荧光蛋白常用于各种生物分子的荧光标记，几乎所有的有机荧光染料和荧光蛋白都是偶极子。当荧光偶极子附着在生物分子上时，其取向又可以直接反映被标记生物分子的方向信息，因此得到偶极子的方向在生物研究中具有特殊意义。偏振荧光显微镜可用于提取荧光偶极子的方向，利用的是偶极子的激发吸收对激发光场偏振方向具有敏感性，即荧光偶极子的激发吸收效率取决于其与激发光偏振方向的夹角δ这一特点。用旋转线性偏振光激发偶极子，其荧光强度信号表现出正比于cos2δ的周期性响应，当偶极子取向与激发光偏振方向平行时，吸收效率最高，荧光强度最强。故提取该正弦响应曲线的相位信息可以确定荧光偶极子的取向信息。

2、但是目前这种利用激发光偏振调制获得偶极子取向信息的研究中，可以获得的信息只有偶极子在探测平面投影的二维取向，无法获取偶极子在样本中的真实三维取向。这是由于目前的荧光偏振显微镜多基于同轴照明系统，即照明光和探测光同轴的系统。在该系统下，偏振激发光场振荡平面平行于荧光探测平面，正弦响应曲线的相位信息仅可推出偶极子在荧光探测平面的投影和旋转线性偏振激发光初始方向之间的夹角，即偶极子在探测平面投影的二维取向。然而该正弦响应曲线可以利用的不仅仅有相位信息，还应有振幅信息。目前虽已证明偶极子荧光强度信号表现出正比于cos2δ的周期性响应，但是正弦响应曲线的振幅信息没有得到充分的利用，无法得到振幅信息提供的偶极子取向信息。

3、综上所述，目前利用激发光偏振调制获得偶极子取向信息的研究多基于同轴照明的成像模式，且缺乏定量模型来准确描述激发光偏振态与探测平面上荧光强度之间的关系。故可以获得的信息只有偶极子在探测平面投影的二维取向，不能准确的得到三维取向信息。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对上述现有技术存在的问题，提供一种基于两路探测的偏振显微成像系统，建立物理模型定量描述激发光偏振态与探测平面总荧光强度之间的关系，并将该模型应用于本发明的显微成像装置，充分利用成像装置所得偏振响应曲线的相位信息和振幅信息，准确解析荧光基团中偶极子三维取向，为揭示生命活动中的分子结构和功能提供信息。

2、实现本发明目的的技术解决方案为：一种用于测量荧光偶极子三维取向的显微成像系统，所述系统包括偏振调制模块、扫描模块、激发模块和探测模块；

3、所述偏振调制模块，用于产生线性偏振激发光；

4、所述扫描模块，用于对线性偏振激发光进行面扫描和深度方向扫描，以实现面激发和对样品进行三维成像；

5、所述激发模块，用于接收扫描模块输出的激发光，对样品进行荧光激发；

6、所述探测模块，用于进行荧光成像。

7、进一步地，所述偏振调制模块包括沿同一光轴依次设置的激光器和半波片，所述激光器为连续光激光器。

8、进一步地，所述扫描模块包括沿偏振调制模块出射光轴依次设置的第一扫描振镜、第一扫描透镜、第一透镜、第二扫描振镜、第二扫描透镜和第二透镜；所述第一扫描振镜用于将线性偏振激发光扫描为面光束，第二扫描振镜用于对样品进行深度方向扫描，实现对样品进行三维成像；所述第一扫描透镜和第一透镜组成4f系统，第二扫描透镜和第二透镜组成4f系统。

9、进一步地，所述激发模块包括沿扫描模块出射光轴依次设置的照明物镜和样品。

10、进一步地，所述探测模块包括两个光路相正交的探测单元，分别记为第一探测单元和第二探测单元，其中第一探测单元的光轴与激发光路径即扫描模块出射光轴正交，包括沿光轴依次设置的第一探测物镜、第三透镜、第一滤波片和第一相机；第二探测单元的光轴与激发光路径同轴，包括沿光轴依次设置的第二探测物镜、第四透镜、第二滤波片和第二相机；启动第一扫描振镜时，样品辐射的荧光由第一探测单元进行荧光成像；同时启动第一扫描振镜和第二扫描振镜时，样品辐射的荧光由第二探测单元进行荧光成像。

11、基于所述系统的用于测量荧光偶极子三维取向的显微成像方法，所述方法包括以下步骤：

12、步骤1，激光器发出的光经过半波片改变偏振角度实现偏振调制；

13、步骤2，启动第一扫描振镜，偏振调制后的激光由第一扫描振镜进行水平扫描，经过第一扫描透镜和第一透镜组成的4f中继系统后，再经第二扫描振镜、第二扫描透镜和第二透镜后进入照明物镜，聚焦到样品上进行荧光激发；

14、步骤3，样品辐射的荧光由光轴与激发光路径正交的第一探测物镜探测收集，经第三透镜后由第一滤波片滤除照明光，之后在第一相机的探测平面进行荧光成像；

15、步骤4，从初始位置以预设固定间隔旋转半波片，记录每个角度下第一相机探测平面的总荧光强度，得到一条激发光偏振调制下正交方向辐射的总荧光强度i正交的偏振响应曲线；

16、步骤5，同时启动第一扫描振镜和第二扫描振镜，偏振调制后的激光由第一扫描振镜进行水平扫描，经过第一扫描透镜和第一透镜组成的4f中继系统，再由第二扫描振镜进行垂直扫描，之后经过第二扫描透镜和第二透镜组成的4f中继系统进入照明物镜，聚焦到样品上进行荧光激发；

17、步骤6，样品辐射的荧光分别由光轴与激发光路径同轴的第二探测物镜探测收集，经第四透镜后由第二滤波片滤除照明光，之后在第二相机的探测平面进行荧光成像；

18、步骤7，从初始位置以预设固定间隔旋转半波片，记录每个角度下第二相机探测平面的总荧光强度，得到一条激发光偏振调制下同轴方向辐射的总荧光强度i同轴的偏振响应曲线；

19、步骤8，基于步骤4和步骤7获得的偏振响应曲线，解析偶极子的三维取向。

20、进一步地，步骤8所述基于步骤4和步骤7获得的响应曲线，解析偶极子的三维取向，具体过程包括：

21、步骤8-1，建立物理模型：

22、设置xoz平面的线性偏振激发光，激发光沿y轴传播，分别在与激发光路径正交的方向有探测平面1，在与激发光路径同轴的方向有探测平面2；

23、在偏振光激发场，偶极子激发吸收效率正比于其中α为激发光偏振角度与x轴正方向的夹角，为偶极子矢量；

24、在辐射场，单偶极子在空间辐射荧光强度正比于sin2θ/r2，其中θ偶极子矢量与荧光波矢量之间的夹角，r为空间任一探测点到偶极子的距离；

25、偶极子在探测方向辐射的荧光被探测物镜孔径角所收集，该孔径角由立体角ω表示；

26、当没有偏振调制时，探测物镜收集的单偶极子荧光强度为常数值∮sin2θ/r2 ds，即∮sin2θdω；结合偏振光激发场和辐射场公式，获得在偏振调制下，探测方向所收集总荧光强度为：∮sin2θdω为常数值，偏振响应曲线的相位为与x轴正方向的夹角，振幅为∮sin2θdω的正弦曲线；

27、步骤8-2，基于上述物理模型，获取同轴方向以及正交方向的偏振响应曲线的相位和振幅，进而得到偶极子三维取向。

28、进一步地，步骤8-2所述基于上述物理模型，获取同轴方向以及正交方向的偏振响应曲线的相位和振幅，进而得到偶极子三维取向，具体过程包括：

29、根据公式由同轴方向或正交方向的偏振响应曲线的相位值获得偶极子与x轴夹角βx；

30、将∮sin2θdω换算为∮sin2(f(βz))dω'，依据正交方向的偏振响应曲线的振幅a1，由公式a1＝∮sin2(f(βz))dω'，计算得到偶极子与z轴夹角βz；

31、将∮sin2θdω换算为∮sin2(f(βz))dω'，依据同轴方向的偏振响应曲线的振幅a2，由公式a2＝∮sin2(f(βy))dω'，计算得到偶极子与y轴夹角βy；

32、由此获得偶极子的三维取向[βx,βy,βz]。

33、本发明与现有技术相比，其显著优点为：

34、1)目前利用激发光偏振调制获得偶极子取向信息的研究多基于同轴照明的成像模式，本发明采用两路探测的方法，将激发光偏振调制同时引入同轴照明成像系统和正交照明成像系统。

35、2)目前利用激发光偏振调制获得偶极子取向信息的研究，可以利用的信息只有偏振响应曲线的相位信息，只能推导出只有偶极子在探测平面投影的二维取向，不能准确得到三维取向信息。而本发明建立的物理模型可以定量描述激发光偏振态与探测平面总荧光强度之间的关系，即得到定量的偏振响应曲线公式。因此除了相位信息，偏振响应曲线的振幅信息也可以得到充分利用，为偶极子其他方向的三维取向提供额外的信息。

36、3)相比于其他获取偶极子取向的方法，即不利用激发光偏振调制获取偶极子取向的方法，本发明成像系统简单，只需在传统的激发光和探测光同轴的偏振荧光显微镜上，加入另一路正交于照明光轴的探测光路即可。且推导过程只与数学模型有关，不参杂与光场调控等复杂推导有关的步骤。

37、下面结合附图对本发明作进一步详细描述。