土壤中磺胺类抗生素的检测方法及其样品处理方法

本发明涉及抗生素检测，具体涉及一种土壤中磺胺类抗生素的检测方法及其样品处理方法。

背景技术：

1、土壤是人类生存的重要资源。随着工业化、城市化、农业集约化的快速发展，大量未经处理的废弃物向土壤系统转移，并在自然因素的作用下汇集、残留于土壤环境中。土壤中污染物的种类复杂多样，主要有重金属、硝酸盐、农药及持久性有机污染物、放射性核素、病原菌/病毒及异型生物质等，给其污染物的检测带来了挑战。

2、磺胺类抗生素(sulfonamides antibiotics，sa)是一种广谱抗生素，包括磺胺嘧啶(sdz)、磺胺噻唑(stz)、磺胺吡啶(spd)、磺胺甲基嘧啶(smi)、磺胺噁唑(smx)、磺胺对甲氧嘧啶(smd)、磺胺甲噻二唑(sml)、磺胺二甲基嘧啶(smz)、磺胺甲氧哒嗪(smp)、磺胺氯哒嗪(scp)、磺胺甲噁唑(smz)、磺胺间甲氧嘧啶(smm)等等，应用比较广泛，容易富集在土壤中。目前磺胺类抗生素的检测方法主要采用仪器分析，例如液相色谱(hplc)检测法(常用检测器)、液相色谱-质谱联用(hplc-ms/lc-ms)检测法等，针对不同的样品和检测目标物一般会采用适用的样品处理方法对样品进行预处理后再采用仪器分析检测，以降低样品中其它物质对检测目标物的干扰。

3、目前磺胺类抗生素检测的前处理方法多是针对水样的，主要是固相萃取法，例如薛鸣等人建立的固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定水样中17种磺胺类抗生素药物(磺胺吡啶、磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲恶唑、磺胺二甲异恶唑、磺胺甲噻二唑、磺胺喹恶啉、磺胺苯吡唑、磺胺多辛、磺胺二甲氧嗪、磺胺醋酰、磺胺苯甲酰、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶和磺胺对甲氧嘧啶)的方法(薛鸣,杨凡绪,金铨,等.固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定水样中17种磺胺类抗生素[j].中国卫生检验杂志,2020,30(13):1537-1541.)，采用吸附材料是由亲脂性二乙烯基苯和亲水性n-乙烯基吡咯烷酮两种单体聚合成的大孔共聚物(hlb)固相萃取柱富集纯化水样中磺胺类抗生素，经csh c18(2.1mm×100mm，1.7μm)色谱柱分离，在电喷雾正离子多反应扫描监测模式下进行测定。庞昕瑞等人建立了固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱(spe-uplc-ms/ms)同时检测地表水中10种磺胺类抗生素的分析方法(庞昕瑞,曾鸿鹄,梁延鹏,等.固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定地表水中10种磺胺类抗生素残留[j].分析科学学报,2019,35(4):461-466.)，过滤后的水样用稀h2so4调节ph至6.0，经hlb固相萃取柱富集净化，依次用乙酸乙酯-甲醇(1：1，v/v)、氨水-甲醇(3：100，v/v)进行洗脱，采用超高效液相色谱-串联质谱法测定，外标法进行定量。

4、对于复杂基质样品中抗生素的检测可以利用净化技术对样品进行预处理，净化多采用固相萃取、基质分散萃取技术等，例如市售的固相萃取柱。土壤中成分复杂，直接用土壤作为样品或者直接用从土壤中简单溶剂提取的提取液作为样品进行磺胺类抗生素的检测存在干扰严重、很难检测到目标物的问题，采用现有填充有吸附材料(例如c18)的固相萃取柱对样品进行萃取净化后再进行后续的仪器分析是一种可行的方法，但采用填充有吸附材料的固相萃取柱对土壤样品进行萃取净化时由于土壤中杂质多特别容易导致固相萃取柱严重堵塞，从而出现降低样品质量达不到检出限标准、化合物丢失严重、检测结果重复性差、成本较高、效率较低等技术问题。

技术实现思路

1、面对现有技术存在的技术问题，本发明提供了一种操作方便、检测结果准确且稳定性好的土壤中磺胺类抗生素的检测方法及其样品处理方法。

2、一种土壤中磺胺类抗生素检测的样品处理方法，包括步骤：

3、(1)mop-bpy cof材料的制备：将三醛基间苯三酚(mop)与5,5'-二氨基-2,2'-联吡啶一起机械研磨，研磨至粉末变成深黄色且继续研磨颜色不发生改变，得到mop-bpy cof材料；

4、(2)fe3o4/mop-bpy cof材料的制备：将mop-bpy cof材料均匀分散在水中，加入三价铁盐和二价铁盐，混合均匀，得到含铁悬浮液，调节ph值至9.5-10.5，在77℃-83℃充分搅拌至少60min，冷却后合成的固体物经分离、洗涤和干燥得到fe3o4/mop-bpy cof材料；

5、(3)称取土壤样品，加入乙腈提取，分离得到第一上清液；将第一上清液与乙二胺-n-丙基硅烷(psa)充分混匀，分离得到第二上清液；将第二上清液与fe3o4/mop-bpy cof材料充分混匀，静置后在磁场作用下分离出磁性材料，将分离出的磁性材料完全浸没在洗脱液中解吸后取出，洗脱液经吹干，得到处理后样品。

6、为了减少或者避免土壤中干扰物质对目标检测物磺胺类抗生素检测的干扰，本发明结合土壤的特点，采用乙腈作为提取剂从土壤中提取出含待测物磺胺类抗生素的提取液，基于psa能去除土壤中的杂质且在乙腈体系下对磺胺类抗生素的吸附低的发现，在用乙腈对土壤样品提取后，加入psa去除提取液中的部分杂质，同时结合本发明机械研磨制备的特定结构的fe3o4/mop-bpy cof材料在土壤乙腈提取液中对磺胺类抗生素的特异性吸附且吸附效果优异的特性进一步从土壤乙腈提取液中特异性吸附磺胺类抗生素，基本可以完成土壤乙腈提取液中所有磺胺类抗生素的吸附，基本无残留，在洗脱液中解吸后得到处理后样品，基本没有基质效应，能够显著降低土壤中干扰物质对目标检测物磺胺类抗生素检测结果的干扰，可显著提高检测结果的准确性。

7、本发明制备的mop-bpy cof材料具有微纳米尺寸，呈表面粗糙且粗细不一的块状结构，可特异性吸附磺胺类抗生素。fe3o4纳米颗粒与mop-bpy cof基体交联后形成表面粗糙度较mop-bpy cof进一步提升且尺寸相对均匀的微纳米fe3o4/mop-bpy cof材料，fe3o4/mop-bpy cof材料在特异性吸附磺胺类抗生素的稳定性上表现更好，有助于提高检测方法的稳定性。

8、所述磺胺类抗生素包括磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺甲噁唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺异恶唑、磺胺苯酰、磺胺氯吡嗪、磺胺苯吡唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉等中的一种或两种以上。

9、为了达到更好的发明效果，做如下优选：

10、步骤(1)中，所述三醛基间苯三酚与5,5'-二氨基-2,2'-联吡啶的质量比为56.7-69.3：83.8，进一步优选63：83.8。

11、所述机械研磨至粉末变成深黄色且继续研磨颜色不发生改变一般需要至少40分钟。机械研磨的前几分钟可观察到粉末逐渐变色，慢慢变成浅黄色粉末，随着研磨时间的增加，粉末逐渐变成深黄色且继续研磨颜色不发生改变，即mop-bpy cof材料成功制备。

12、步骤(2)中，所述三价铁盐可选用氯化铁(fecl3)、氯化铁水合物(例如fecl3·6h2o)、硫酸铁、硫酸铁水合物(例如fe2(so4)3·7h2o)、硝酸铁、硝酸铁水合物(例如fe(no3)3·9h2o)等中的一种或两种以上。为了便于操作、减少采购原料的种类，可选用一种三价铁盐。

13、所述二价铁盐可选用硫酸亚铁(feso4)、硫酸亚铁水合物(例如feso4·7h2o)、氯化亚铁、氯化亚铁水合物(四水合氯化亚铁)、葡萄糖酸亚铁、葡萄糖酸亚铁水合物(葡萄糖酸亚铁二水合物)等中的一种或两种以上。为了便于操作、减少采购原料的种类，可选用一种二价铁盐。

14、本发明采用二价铁盐、三价铁盐与mop-bpy cof材料基于共沉淀法在反应过程中制备fe3o4，fe3o4在制备过程中与mop-bpy cof材料进行交联，均一性好，且提高fe3o4/mop-bpy cof材料的产率。如果直接采用fe3o4颗粒与单体三醛基间苯三酚、5,5'-二氨基-2,2'-联吡啶反应制备fe3o4/mop-bpy cof材料，fe3o4与mop-bpy cof材料交联的均一性会变差，fe3o4/mop-bpy cof材料的产率较本发明共沉淀法偏低。

15、所述mop-bpy cof材料与三价铁盐中三价铁、二价铁盐中二价铁的质量比为1：2-3：1.2-2；进一步优选1：2.35：1.43。该用量范围得到的fe3o4/mop-bpy cof材料的磁性适当、单位质量材料的吸附效果更优异。本发明fe3o4/mop-bpy cof材料中mop-bpy cof材料含量过高，fe3o4/mop-bpy cof材料的磁性会有所降低，会适当增加分离操作的时间；mop-bpycof材料含量过低，单位质量的材料吸附效果会有所降低，需要适当增加fe3o4/mop-bpy cof材料的使用量。

16、所述mop-bpy cof材料均匀分散在水中的浓度对fe3o4/mop-bpy cof材料的磺胺类抗生素吸附和解吸能力影响不大，主要为了保持均匀分散的状态，便于与生成的fe3o4交联。

17、调节ph值所用的调节剂选用碱液，例如氨水、氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液等碱性ph调节剂中的一种或多种。优选氨水，例如质量百分浓度30％的氨水。氨水对形成fe3o4的效率比较高，反应更快速。

18、所述在77℃-83℃充分搅拌可选择在油浴中进行，加热均一性好。

19、所述洗涤可采用经乙醇洗涤多次后经水洗涤多次。

20、所述干燥可采用在50℃-75℃真空干燥1小时-1.5小时。

21、步骤(3)中，所述乙腈提取的条件选用：先涡旋1min-2min，再超声提取至少15min；进一步优选超声提取15min-20min。先涡旋利于土壤样品与乙腈混合均匀，再超声提取一段时间利于目标物被充分提取。

22、所述乙腈的毫升数与土壤样品的克数之比至少为5:1，能够从土壤中提取出有效量的待测物磺胺类抗生素，增加乙腈的用量对提取效果没有影响，从节约成本的角度考虑，优选乙腈的毫升数与土壤样品的克数之比为5:1。

23、本发明发现psa能去除土壤中的杂质且在乙腈体系下对磺胺类抗生素的吸附低，因此在用乙腈对土壤样品提取后，加入psa去除提取液中的杂质。所述psa的毫克数与第一上清液的毫升数之比至少为41:1。进一步优选，所述psa的毫克数与第一上清液的毫升数之比为41:1，增加psa用量不能明显提高去杂质效果。

24、本发明发现fe3o4/mop-bpy cof材料在土壤乙腈提取液中对磺胺类抗生素的吸附效果优异，基本可以完成土壤乙腈提取液中所有磺胺类抗生素的吸附，基本无残留，可显著提高检测结果的准确性。所述fe3o4/mop-bpy cof材料的毫克数与第二上清液的毫升数之比在90-150：1。该用量范围能够从第二上清液中提取出有效量的待测物磺胺类抗生素，超过该范围增加fe3o4/mop-bpy cof材料的用量对从第二上清液中提取磺胺类抗生素的效果会减弱。进一步优选fe3o4/mop-bpy cof材料的毫克数与第二上清液的毫升数之比为100-150：1。

25、所述洗脱液选用由甲醇和质量百分浓度0.5％甲酸水溶液按体积比3：7组成的洗脱液。

26、所述解吸时间优选为至少4min。

27、一种土壤中磺胺类抗生素的检测方法，采用所述样品处理方法得到的处理后样品作为测试样品，直接采用现有磺胺类抗生素的检测方法中的一种或者多种进行检测。所述的检测方法，可包括：取测试样品，直接采用现有磺胺类抗生素的液相色谱检测法(常用检测器)或者磺胺类抗生素的液相色谱-质谱联用检测法检测测试样品中磺胺类抗生素。

28、所述测试样品优选采用乙腈水溶液稀释后，过滤，进样。

29、所述乙腈水溶液中乙腈与水的体积比优选为1:1。

30、本发明所用的原料、试剂等均可采用市售产品。

31、本发明具有以下有益效果：

32、与传统的固相萃取柱填料、现有吸附材料相比，本发明在面对土壤这种复杂样品时采用简单三步法净化土壤样品：先采用对磺胺类抗生素具有高提取率的乙腈初步提取，再利用psa能去除土壤中的杂质且在乙腈体系下对磺胺类抗生素吸附低的性能，在用乙腈提取土壤样品后加入psa去除杂质，最后加入比表面积大且在有机溶剂中结构稳定的fe3o4/mop-bpy cof材料通过氢键、分子间作用力等特异性吸附目标化合物磺胺类抗生素，然后用洗脱液将fe3o4/mop-bpy cof材料中吸附的磺胺类抗生素洗脱下来；利用fe3o4/mop-bpycof材料的磁性，简单施加一个外部磁场即可实现相分离，操作简单、快速，避免了传统固相萃取柱填料吸附剂需装柱和等待样品上样净化等耗时问题以及土壤中杂质多特别容易导致固相萃取柱严重堵塞的问题。

33、采用本发明合成的fe3o4/mop-bpy cof材料作为吸附材料用于土壤中磺胺类抗生素提取，回收率均在70％以上；且使用过的fe3o4/mop-bpy cof材料经过水洗、丙酮洗涤后可重复使用，材料重复使用3次后回收率未见明显降低。因此具有很大的应用前景。

34、采用本发明样品处理方法得到的处理后土壤样品能够有效的克服土壤中其他物质对磺胺类抗生素检测的干扰，检测结果准确，检测方法的稳定性好。

35、本发明可用于大体积样品溶液中磺胺类抗生素的萃取，操作简便、快速且检测结果准确，能够广泛的推广应用。