一种基于抗原-抗体作用的胆碱乙酰转移酶双模式分析方法

本发明涉及双模式分析方法的构建及其在胆碱乙酰转移酶活性分析中的应用，尤其是涉及基于抗原-抗体作用的分析传感方法及超电荷荧光蛋白和共价框架材料的应用，属于纳米生物材料和化学生物传感。

背景技术：

1、胆碱能神经元作为一种重要的功能神经元广泛存在于中枢神经系统中，具有不同形态特征和行使着多种功能，如参与人类运动、学习和记忆等生理活动，同时又是临床上多种中枢神经系统退行性疾病的靶细胞。因此，胆碱能神经元的发生及发生机制一直是神经科学研究的热点，也是理解中枢神经系统功能和探索其疾病治疗途径的基础。近几年来，对端脑发育无论是细胞水平还是分子水平均有很大进展，但是，对端脑中胆碱能神经元的胚胎发生却知之甚少。其中，乙酰胆碱转移酶(chat)是合成神经递质乙酰胆碱的限速酶，作为胆碱能神经元的标志性蛋白，利用免疫组织化学染色可以显示其表达区域，从而追踪胆碱能神经元的发生、迁移及最后分布，可是放射状胶质细胞表达的chat到底在什么区间呢？由于其丰度极低，急需一些简单、灵敏的分析传感方法，实现细胞中低浓度的chat分析监测。

2、绿色荧光蛋白(gfp)是一种生物自身编码表达的、无生物毒性、高量子产率、低成本的荧光标记分子，在生物学、医学等领域得到了广泛应用。绿色荧光蛋白在紫外灯照射下就可以发出强烈的绿光，并且对光漂白、高盐溶液、热或者碱都具有很强的耐受能力2007年，liu教授科研组将gfp表面的不带电荷氨基酸突变为带正电荷的氨基酸，得到了带有36个正电荷的超正电荷绿色荧光蛋白scgfp，这种蛋白生物相容性好、稳定性好、荧光光谱单一、荧光强度强、抗光漂白能力强等优点。目前对超正电荷绿色荧光蛋白的研究与应用还很少，主要是利用其生物相容性好的特点，用于载药运输，成像研究等，利用它带36个正电荷的性质及荧光的性质可以设计相关的生物传感器。据我们所知，目前尚未出现scgfp用于细胞中低浓度的chat分析监测的报导。

3、本发明专利选用放射状胶质细胞中低丰度的chat作为主要研究目标，创建了一种双模式检测方法，涉及到荧光技术及电化学技术。首先，在一定距离内，原位生长的金簇@共价框架纳米材料(au@cof)可淬灭scgfp在506nm的荧光强度，而chat可成为这一桥梁，拉近它们之间的距离，促进荧光强度的淬灭效率，从而通过荧光强度的前后变化来讨论chat的含量；其次，由于静电吸引作用，scgfp和go可以较好地结合在一起，修饰了chat抗体的上述材料能够较好地修饰到电极表面，当加入一定量的chat，可以将修饰了chat抗体的au@cof进一步固定到电极表面，该电极对h2o2具有较好的电化学响应，从而通过电化学信号的前后变化来讨论chat的浓度。在该双模式检测方法中，一个呈现信号衰减，另一个呈现信号增加，通过相互照应可以避免假阳性信号的产生，使得分析结果更加准确可靠。这种双模式方法为今后进一步研究细胞中低浓度的chat分析监测提供了基础理论和检验方法。目前为止，尚未发现基于抗原-抗体作用的胆碱乙酰转移酶双模式分析方法及应用的相关报导。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低的一种基于抗原-抗体作用的胆碱乙酰转移酶双模式分析方法。

2、本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于抗原-抗体作用的胆碱乙酰转移酶双模式分析方法，具体步骤如下：

3、(1)au@cof合成

4、a.取2，4，6-三(4-醛基苯基)三嗪(0～16mg，0.01～0.063mmol)、三(4-氨基苯基)胺(5～17mg，0.03～0.07mmol)、二氯苯/正丁醇(v/v＝2～6ml/1～2ml)混合置于圆底烧瓶中，搅拌2～10min后加入0.1～0.2ml乙酸(1～6m)，在氮气氛围下室温搅拌12～72h。反应结束后过滤出沉淀物，并分别用四氢呋喃(12～24h)、甲醇(12～24h)和丙酮(12～24h)索氏萃取。在80～120℃下真空干燥过夜后，得到黄色cof粉末。

5、b.再将上述cof粉末(0.010～0.020g)悬浮于100～250μm(5～15ml)的haucl4水溶液中并在冰浴中剧烈搅拌，随后逐滴加入0.1～1ml 0.005～0.01m的nabh4水溶液，继续搅拌5～10min，通过离心、水和乙醇洗涤、真空干燥得到最终产物。在1～2mg该纳米材料中加入0.1～1ml二甲基亚砜，混匀后，再加入0.1～1ml二次蒸馏水，分散为0.2～1mg/ml的溶液，备用。

6、c.取200～500μl 20～100μg/ml的胆碱乙酰转移酶抗体(ab1)和500～1500μl 0.2～1mg/mlau@cof混合，于30～37℃孵育20～180min，标记为ab1-au@cof。

7、(2)胆碱乙酰转移酶分析传感方法及应用

8、a.取200～500μl 50～100μg/ml的胆碱乙酰转移酶抗体(ab2)和500～1500μl 100～500nm scgfp混合，于30～37℃孵育50～180min，标记为ab2-scgfp。

9、b1.荧光方法——取2～10μl步骤(1c)中ab1-au@cof溶液和2～10μl步骤(2c)中ab2-scgfp，10～50μl 0.01～0.05m pbs(ph 7.2)，2～20μl超纯水，再加入5～10μl 200～1000mu/ml chat，于32～37℃孵育5～10min。置于荧光仪中测量波长范围430～650nm的荧光强度(狭缝宽度为10nm)。

10、b2.电化学方法——将裸玻碳电极(gce)清洗干净，再将1～2μl步骤(2c)中ab2-scgfp、1～2μl 0.2～1mg/ml的石墨烯(go)和2～6μl 0.1～0.2wt％壳聚糖混合后于30～37℃孵育2～10min，再滴入gce表面于30～37℃孵育2～10min，用0.05m pbs(ph 7.2)缓缓清洗电极(电极2)。再取1～5μl 200～1000mu/ml chat滴入上述电极表面，于30～37℃静置5～10min后(电极3)，不清洗状态下再加入1～5μl步骤(1c)中ab1-au@cof溶液，于30～37℃孵育额外的10～20min(电极4)。随后再置于含有5mm h2o2的0.05m pbs(ph 7.2)中进行电化学检测，电位范围为-1.2～0v(扫描速度为50mv/s)。另外，将1～2μl 0.1～1mg/ml的石墨烯(go)、2～6μl 0.2wt％壳聚糖、1～2μl超纯水混合后于30～37℃孵育5～10min，再滴入gce表面于25～37℃孵育5～10min，用0.05m pbs(ph 7.2)缓缓清洗电极，制备电极1作为对比。

11、基于以上(1)-(2)步骤，针对几种不同的酶类(如蛋白激酶等)，通过改变步骤(2)酶的类型，其它步骤不变，可实现胆碱乙酰转移酶选择性分析。

12、基于以上(1)-(2)步骤，改变chat的浓度(荧光：终浓度0～150mu/ml；电化学：终浓度0～100mu/ml)，其它步骤不变，可实现不同浓度胆碱乙酰转移酶的分析。

13、利用上述一种基于抗原-抗体作用的胆碱乙酰转移酶双模式分析方法，利用酶标仪中荧光方法，设置波长范围为430nm～650nm，狭缝宽度为10nm，利用制备的au@cof对scgfp荧光的淬灭效应，通过chat来控制这一变化进程，实现chat的荧光分析检测，通过改变chat浓度获得一系列不同浓度chat对应的荧光强度大小，建立荧光强度响应与chat浓度之间的线性关系，根据两者之间的线性关系，确定实际细胞样本中chat浓度。利用电化学工作站中的循环伏安发，设置电位范围为-1.2v～0v，扫描速度为50mv/s，利用au@cof对h2o2的电化学催化作用，通过chat来控制这一变化进程，实现chat的电化学分析检测，通过改变chat浓度获得一系列不同浓度chat对应的电化学电流大小，建立电流响应与chat浓度之间的线性关系，根据两者之间的线性关系，确定实际细胞样本中chat浓度。

14、发明原理：本发明是一种基于抗原-抗体作用的胆碱乙酰转移酶双模式分析方法，scgfp在506nm处有较好的荧光现象，基于au@cof对scgfp荧光的淬灭机理，而当它们之间距离较大时，无淬灭现象，而chat可通过抗原-抗体作用拉近它们之间的距离，促进淬灭作用；对于电化学模式，au@cof可以较好地催化h2o2的电化学还原，而scgfp@go可以较好地固定在电极表面，chat可通过抗原-抗体作用将au@cof固定在电极表面，促进h2o2的电化学催化。本专利利用上述所提分析检测原理，基于抗原-抗体作用不仅实现了不同浓度的chat分析检测，而且为实际细胞样本中chat的高灵敏检测提供了一种新的思路。

15、现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种基于抗原-抗体作用的胆碱乙酰转移酶双模式分析方法，显然，au@cof能够淬灭scgfp荧光，在一定浓度范围内，chat浓度越大，荧光淬灭的越多；同理，au@cof能够催化h2o2的电化学还原，在一定浓度范围内，chat浓度越大，电化学信号越明显。实验结果表明，荧光(电流)强度的大小与chat浓度在一定范围内呈现线性关系，成功实现对chat的分析检测。其优点在于：

16、(1)新颖的设计。本专利第一次一种基于抗原-抗体作用的胆碱乙酰转移酶双模式分析方法，该方法克服了单一信号带来的假阳性信号，以两种信号相反的变化实现胆碱乙酰转移酶的准确检测。

17、(2)高灵敏度。本发明基于au@cof能够淬灭scgfp荧光，得到一条线性方程：荧光响应对chat浓度线性相关方程为y＝-1097.8x+3938.2，r2＝0.9827，线性范围为0.01～150mu/ml，检测的最低浓度为0.01mu/ml；同理，基于au@cof对h2o2的电化学还原，得到一条线性方程：电流响应对chat浓度线性相关方程为y＝7.3316x+25.7063，r2＝0.9907，线性范围为0.005～100mu/ml，检测的最低浓度为0.005mu/ml；说明该传感器可对chat实现高灵敏度检测。

18、(3)高特异性。本专利是利用chat及其抗体作为主要作用力，因此具有较强的特异性，能够对chat实现选择性检测。

19、(4)结果准确。回收率均在93％～104％之间。

20、(5)制备与检测方法试剂用量少、成本低。本发明只需消耗少量材料和试剂就可实现对chat的高灵敏检测。

21、综上所述，本发明是基于抗原-抗体作用的胆碱乙酰转移酶双模式分析方法及应用，具有灵敏度高、选择性好、操作简单、分析快速、易于操作等优点，可以实现低浓度chat的检测，具有良好的应用前景。