同步测定热反应香精中丙烯酰胺、4-甲基咪唑和羟甲基糠醛的方法

本发明属于食品安全，具体涉及一种同步测定热反应香精中丙烯酰胺、4-甲基咪唑和羟甲基糠醛的方法。

背景技术：

1、富含碳水化合物的食品在超过120℃的高温条件下加工的过程中会产生丙烯酰胺(acrylamide,简称aa)。研究表明，丙烯酰胺具有神经毒性、生殖毒性、免疫毒性、遗传毒性以及潜在的致癌、致突变性，其中神经毒性已在人体内得到了证实。国际癌症研究机构(international agency for research on cancer,简称iarc)已将丙烯酰胺列为2a型致癌物(很可能对人类致癌)。丙烯酰胺可通过多种途径形成，包括含有碳水化合物和天冬酰胺的美拉德反应和仅含有油脂和天冬酰胺的丙烯醛途径，故在大量热加工食品中都可检测到丙烯酰胺。

2、4-甲基咪唑(4-methylimidazole,简称4-mi)是美拉德反应和亚硫酸铵参与的焦糖化反应过程中生成的副产物，在许多热加工食品中都有分布，尤其是添加了焦糖色的食品，如着色饮料等。国际上已经注意到4-甲基咪唑具有致癌性，iarc已将4-甲基咪唑列为2b型致癌物(可能对人类致癌)。国外有针对幼鼠和幼年斑马鱼的研究发现4-甲基咪唑可能具有遗传毒性。

3、食品在热加工的过程中，由于美拉德反应或糖的热解均会产生羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural,简称hmf)，除此之外，在食品储藏期间羟甲基糠醛同样会累积。毒理学研究表明，羟甲基糠醛具有细胞毒性，摄入一定量后会导致神经退行性疾病、糖尿病和心血管疾病等；除了对健康的直接影响，羟甲基糠醛在体内还会转化为多种其他有毒化合物，如氯甲基糠醛、磺基甲基糠醛、甲酸等，这些物质具有致突变性。

4、《中国酿造》2022年第41卷第1期第217～220页公开了一种茶叶中丙烯酰胺的检测方法，该方法采用quechers预提取和mcx固相萃取进行前处理，超高效液相色谱串联三重四极杆质谱进行定性和定量。《食品安全质量检测学报》2021年第12卷第22期第8703～8710页公开了一种白酒中甲基咪唑和羟甲基糠醛的同步检测方法，该方法采用直接稀释法和标准加入法进行前处理，超高效液相色谱串联三重四极杆质谱进行定性和定量。

5、目前，仅有少部分关于热反应香精中危害物检测方法的报道，涉及羟甲基糠醛、氯丙醇和一种杂环胺。而针对热反应香精中其他危害物的检测和多种危害物的同步检测方法还未见报道。热反应香精在各种食品中应用广泛，有必要建立一种快速、准确地同步检测其中多种危害物的方法以达到食品安全的目的。

技术实现思路

1、本发明旨在解决上述问题，提供了一种同步测定热反应香精中丙烯酰胺、4-甲基咪唑和羟甲基糠醛的方法，检测灵敏度高、重复性好，可大幅提升检测效率，以达到食品安全的目的。

2、按照本发明的技术方案，所述同步测定热反应香精中丙烯酰胺、4-甲基咪唑和羟甲基糠醛的方法，包括以下步骤，

3、s1：采用quechers法对热反应香精进行预提取，得到预提取样品；

4、s2：采用mcx固相萃取柱对所述预提取样品进行固相萃取，得到前处理样品；

5、s3：采用超高效液相色谱串联三重四极杆质谱同步测定所述前处理样品中的丙烯酰胺、4-甲基咪唑和羟甲基糠醛。

6、本发明方法适用于热处理条件下通过美拉德反应制备的热反应香精，香精原料及美拉德反应条件执行《gb 30616-2020食品安全国家标准食品用香精》。

7、进一步的，所述步骤s1中，采用quechers法对热反应香精进行预提取前还包括，对所述热反应香精进行脱脂处理的操作。即所述热反应香精为脱脂处理后的热反应香精。

8、进一步的，采用离心法进行脱脂处理。

9、具体的，脱脂处理的溶剂为正己烷，添加量为热反应香精质量的0.8-1.2倍。

10、本发明中，由于热反应香精中含有未反应完全的还原糖和部分水溶性色素，对危害物的测定有干扰作用，故首先采用quechers法进行分散固相萃取，将3种危害物保留在有机相中而其他的干扰物质大都保留在水相中被分离。

11、进一步的，所述步骤s1中，quechers法采用的吸水剂为无水硫酸镁，所述无水硫酸镁的添加量为所述热反应香精质量的4-8倍，优选为6倍；富集溶剂为乙腈。

12、进一步的，所述步骤s1中，quechers法加入无水硫酸镁的同时还加入有ph调节剂。所述ph调节剂用于将体系ph向碱性调节，从而增大羟甲基糠醛的提取效率。

13、进一步的，所述ph调节剂为乙酸钠，ph调节剂的添加量为所述热反应香精质量的1.2-1.8倍。

14、具体的，所述步骤s1中，quechers法的具体操作如下：首先向样品中加入水(蒸馏水)并涡旋使之分散，接着加入乙腈，超声8-12min以充分提取3种危害物。超声后加入无水硫酸镁脱去有机相中的水分，无水硫酸镁的用量为4-8倍样品质量；同时加入ph调节剂(乙酸钠)促使两相分层并略微升高ph以提高碱性化合物羟甲基糠醛的回收率，ph调节剂的用量为1.2-1.8倍样品质量。最后，将整个分散体系于3000-6000rpm下离心4-8min以使之完全分层。由于密度的差异，上层为乙腈层，下层为水层，而3种危害物极性较小，绝大部分保留在乙腈层中，故将乙腈层收集即得到初步提取液。

15、由于本方法要求准确地同步测定多种危害物，初步提取的样本中仍存在一些干扰测定的杂质，需要采用更加强力的分离手段来进一步纯化，而固相萃取则满足这一要求。常用的提取这3种危害物地固相萃取柱有mcx柱和hlb柱，但考虑到这些危害物的极性较大，hlb柱难以保留强极性物质，加之羟甲基糠醛是碱性的，更适用于mcx柱，故将固相萃取柱优选为mcx柱。

16、进一步的，所述步骤s2中，mcx固相萃取柱依次采用甲醇、蒸馏水和0.1mol/l盐酸进行活化，上样后依次采用0.1mol/l盐酸和甲醇进行淋洗，最后采用5％氨水甲醇进行洗脱。

17、具体的，所述步骤s2的操作如下：首先，依次使用6ml(2倍柱体积)甲醇、蒸馏水和0.1mol/l盐酸活化萃取柱；将上一步收集的乙腈层在氮气下吹干并用3ml(1倍柱体积)乙腈复溶，然后将其装入萃取柱；接着依次使用6ml(2倍柱体积)0.1m hcl和6ml甲醇淋洗，最后使用6ml(1倍柱体积)甲醇-氨(甲醇:氨水＝95:5,v/v)进行洗脱，收集洗脱液，使用氮气吹干后用300μl初始流动相复溶，经0.22μm针头式过滤器过滤后保存待测。

18、进一步的，所述步骤s3中，超高效液相色谱如下：色谱柱为xbridge c18色谱柱、acquity beh c18色谱柱和agilent hilic-z色谱柱。柱温为20～40℃。流动相体系为乙腈-甲酸、甲醇-甲酸。流动相流速为0.3ml/min。

19、为了保证3种化合物在色谱柱中的分离效果以及峰形，色谱柱优选acquity behc18柱，柱温优选35℃。

20、为了提高化合物的离子化程度，从而降低检测限和定量限、提高灵敏度，流动相体系优选乙腈-甲酸，甲酸浓度优选0.1％。

21、由于本发明要求同时测定多种危害物，质谱检测模式选择mrm(多反应监测)，对目标化合物的检测最为灵敏，干扰也最低。由于待测化合物含有氨基加之羟甲基糠醛具有碱性，离子化方式使用esi+(正离子模式)。

22、为了提高检测灵敏度，毛细管电压优选3.55kv，离子源温度优选110℃，脱溶剂气温度优选400℃。

23、锥孔气和脱溶剂气为氮气，流速分别为50l/h和600l/h；碰撞气为氩气，流速为9ml/h。

24、进一步的，所述步骤s3中，丙烯酰胺、4-甲基咪唑和羟甲基糠醛的检测参数为：

25、丙烯酰胺：母离子72m/z，子离子55m/z，锥孔电压15v，碰撞能量15ev，驻留时间0.1s；

26、4-甲基咪唑：母离子83m/z，子离子56m/z，锥孔电压30v，碰撞能量15ev，驻留时间0.1s；

27、羟甲基糠醛：母离子127m/z，子离子109m/z，锥孔电压17v，碰撞能量10ev，驻留时间0.1s。

28、本发明的技术方案相比现有技术具有以下优点：

29、(1)本发明的方法可同步测定热反应香精中的丙烯酰胺、4-甲基咪唑和羟甲基糠醛，检测灵敏度高、精密度高(rsd＝3.99～5.18)，可大幅提升检测效率。

30、(2)本发明的样品前处理方法简便、安全、环保，不涉及复杂的处理过程而有效对样品进行纯化，对检测人员的要求较低。

31、(3)本发明可保证热反应香精中的危害物水平在可接受的范围内，保障了消费者的食品安全和健康。