一种基于双波长等基线差示融合图谱的中药陈皮质量分析方法

本发明属于中药质量控制，具体涉及以陈皮对照药材为基准物质，建立一套不依赖于多种对照品，基于双波长等基线差示融合图谱的较为全面控制中药陈皮药材质量的方法，此方法稳定合理，可以弥补目前陈皮药材质量控制的不足，为陈皮药材质量提升方法提供参考。

背景技术：

1、陈皮为芸香科植物橘 citrusreticulata blanco或其栽培变种的干燥成熟果皮，药材分为“陈皮”和“广陈皮”。釆摘成熟果实，剥取果皮，晒干或低温干燥即得，收载于《中国药典》2020年版一部。其味苦、辛，性温，具有理气健脾、燥湿化痰的功效，用于脘腹胀满、食少吐泻、咳嗽痰多。陈皮在我国广西、福建、贵州、湖南、江西、四川、重庆、云南等多省均有分布。现代药理学研究表明陈皮具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、促消化、祛痰、保肝、降血压和神经保护等多种药理作用。同时证明黄酮及其苷类是陈皮含量最高成分，也是其药效成分，包括芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素等。

2、目前，中药质量控制方法主要包括单指标含量测定法、多指标含量测定法、一测多评法和指纹图谱与含量测定结合法等。以上方法具有灵敏度高、重复性好、指标明确的优点，能够为陈皮药材质量控制提供量化数据，但也存在着单一指标不能反映药材整体特征、多指标含量测定依赖于多种对照品且某些指标成分不能反映药效、指纹图谱只能模糊地评价药材相似性不能清晰地判断供试品真伪优劣的不足，且中药复杂体系质量评控技术难度和高额成本给中药企业带来了巨大的压力，因而对中药临床合理用药和临床疗效提升的指导和支持作用一直难以体现。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明提供一种基于双波长等基线差示融合图谱的中药陈皮质量分析方法。以陈皮对照药材为定性的基准物质，采用高效液相色谱结合q-tof-ms技术，建立一套不依赖于多种对照品，较为全面科学地控制陈皮药材质量的方法。

2、为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。

3、本发明提供了一种基于双波长等基线差示融合图谱的中药陈皮质量分析方法，其特征在于，所述方法为对两个波长下的图谱进行融合的双波长等基线差示融合法。

4、进一步地，所述双波长等基线差示融合法建立双波长等基线差示融合图谱的具体步骤如下：

5、（1）取对照药材和供试药材进样检测，每份样品双样双针；

6、（2）分别从工作站中导出283 nm、330 nm的csv和aia格式的数据，将283 nm、330nm的csv数据选取最大响应值进行全时段等基线融合；

7、（3）将21~24 min响应较高的数据替换为330 nm响应稍低的数据，最终得到双波长等基线差示融合数据；

8、（4）aia格式数据经“中药指纹图谱相似度评价软件”转换为txt数据，以差示融合数据替换txt格式中的响应数据，保存txt数据，即得双波长等基线差示融合图谱。

9、进一步地，所述方法通过陈皮药材特征图谱中的特征峰作为陈皮药材的定性标准，能够明确鉴定药材的真伪。

10、进一步地，所述方法通过建立的特征峰相对含量的计算方法确定的各特征峰相对含量的下限，能够区分陈皮的优劣。

11、本发明还提供了一种基于双波长等基线差示融合图谱的中药陈皮质量分析方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

12、步骤1 基于对照药材的陈皮药材定性研究；

13、（1）溶液的制备：取陈皮对照药材粉末或陈皮药材粗粉，过二号筛，0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，密塞，称定重量，超声处理（功率300 w，频率40khz）45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液过0.22 μm微孔滤膜，即得；

14、（2）色谱条件：色谱柱：agilent poroshell 120 sb-c18（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）；流动相：0.1%甲酸水（a）-乙腈（b），梯度洗脱；洗脱程序：0～5 min，5%→5% b；5～6 min，5%→13% b；6～15 min，13%→13% b；15～17 min，13%→22% b；17～25 min，22%→22% b；25～30 min，22%→55% b；30～40 min，55%→55% b；40～45 min，55%→100% b；流速：0.6 ml/min；柱温：30℃；dad检测器波长：283 nm、330 nm；进样量：5 μl；

15、（3）双波长等基线差示融合图谱的建立：取陈皮对照药材和10批供试药材按（1）和（2）所述方法进样检测，每份样品双样双针；分别从工作站中导出283 nm、330 nm的csv和aia格式的数据，将283 nm、330 nm的csv数据选取最大响应值进行全时段等基线融合，为了使图谱更全面清晰反应药材质量，将21~24min响应较高的数据替换为330 nm响应稍低的数据，最终得到差示融合数据；aia格式数据经“中药指纹图谱相似度评价软件”转换为txt数据，以差示融合数据替换txt格式中的响应数据，保存txt数据，即得双波长等基线差示融合图谱；

16、（4）特征图谱的建立：将步骤3所得双波长等基线差示融合图谱导入“中药指纹图谱相似度评价软件”，获得10批供试药材的hplc指纹图谱；以陈皮对照药材的图谱为参照谱图，使用中位数进行自动匹配，加以多点校正，标点特征峰，生成共有模式r，与对照药材特征图谱进行比对；

17、（5）相似度评价：以特征峰的相似度明确陈皮药材真伪；供试药材与对照药材的相似度为0.494~0.559；

18、（6）特征峰化学成分解析：采用q-tof-ms技术，通过分析化合物的保留时间、一级离子质荷比以及二级离子碎片信息，并与相关文献报道信息进行匹配，6号峰为芸香柚皮苷，7号峰为橙皮苷，10号峰为川陈皮素，11号峰为橘皮素；

19、步骤2 基于内标物质的特征峰化学成分相对定量研究：

20、7号峰“橙皮苷”为《中国药典》2020年版一部陈皮“含量测定”项下规定的指标，该峰分离效果好、保留时间稳定居中、标准品价格低廉，故以其作为内标物质，开展基于内标物质的特征峰化学成分相对定量研究；取“平均数-标准差”作为特征峰化学成分相对于内标物质化学成分的相对含量下限，供试药材根据此方法测得的特征峰相对含量不低于该含量下限为优；

21、步骤3 方法学考察：

22、（1）专属性试验：分别取混合对照品溶液、供试品溶液，按上述色谱条件进样分析，结果显示各主峰与杂质峰分离度良好，专属性强；

23、（2）线性与范围：取橙皮苷对照品溶液，逐级稀释2倍，得橙皮苷6个质量浓度溶液，分别按上述色谱条件进样分析，以质量（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，得到线性回归方程（y=1120x- 8.4444），相关系数r=0.9999，结果表明橙皮苷在0.1563~5.000 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系；

24、（3）精密度试验：取同一供试品溶液，在上述色谱条件下连续进样6次，测定各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，计算rsd值；结果显示各色谱峰相对保留时间、相对峰面积rsd值均小于0.87%，表明仪器精密度良好；

25、（4）稳定性试验：取同一供试品溶液，在上述色谱条件下，分别于制备后0、2、4、8、12、24 h进样，测定各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，计算rsd值；结果显示各色谱峰相对保留时间、相对峰面积rsd值均小于1.4%，表明供试品溶液在24 h内稳定；

26、（5）重复性试验：取同一批次样品，平行制备6份供试品溶液，在上述色谱条件下进样检测，测定橙皮苷含量及各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，计算rsd值；结果显示橙皮苷平均含量为6.53%，rsd为1.6%；各色谱峰相对保留时间、相对峰面积rsd值均小于1.9%，表明方法重复性良好；

27、（6）加样回收率：精密称定陈皮药材粉末6份，每份0.1 g，分别精密加入相当于0.1g药材含量得橙皮苷对照品，按上述方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样检测，计算得到橙皮苷的平均加样回收率为98.8%（n=6），rsd为1.3%。

28、进一步地，所述步骤2的特征峰均为陈皮发挥其功效及药理作用的特征活性化学成分。

29、进一步地，所述方法通过陈皮药材特征图谱中的特征峰作为陈皮药材的定性标准，能够明确鉴定药材的真伪。

30、进一步地，所述方法通过建立的特征峰相对含量的计算方法确定的各特征峰相对含量的下限，能够区分陈皮的优劣。

31、与现有技术相比本发明的有益效果。

32、（1）本发明紧扣中药多成分、多功效和整合作用的质量内涵和特点，以能够反映其药效的化学成分为指标；采用一种自身参照物对特征峰化学成分进行相对定量，不需要购买大量对照品，尽可能控制供试药材有效化学成分含量。同时，针对单一波长部分成分响应值低以及不同波长主成分响应值均过高，导致图谱反应药材成分信息不全的情况，采用双波长等基线差示融合法对两个波长下的图谱进行融合。在满足中药化学成分“整体性”与“清晰性”的同时减轻了中药复杂体系质量评控成本。本发明以对照药材为基准物质构建特征图谱，并以可代表陈皮药效的有限个代表性成分作为特征峰，评价对照药材和供试药材特征峰的相似度，可以用于判断陈皮的真伪；选用保留时间稳定且价格低廉易获得的内标物质作为定量评价指标，开展基于内标物质的特征峰化学成分相对定量研究，通过内标物质化学成分准确定量，计算供试药材特征峰化学成分的相对含量。此方法可有效解决陈皮有效成分同时快速测定和中药复杂体系质量评控成本高的问题。

33、（2）本发明首次公开一种基于双波长等基线差示融合图谱的中药陈皮质量分析方法，可以弥补目前陈皮药材质量控制方法中单一指标不能反映药材整体特征、多指标含量测定依赖于多种对照品且某些指标成分不能反映药效、指纹图谱只能模糊地评价药材相似性不能清晰地判断供试品真伪优劣的不足。

34、（3）本研究选取分离度良好、信噪比大于10的色谱峰作为特征峰，共确定了11个特征峰。采用质谱技术指认出的陈皮特征峰化学成分为黄酮类。有研究表明陈皮黄酮类成分可显著抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球杆菌和枯草芽孢杆菌。除此之外，芸香柚皮苷可通过抑制nlrp3炎性小体发挥抗炎活性；橙皮苷具有降低葡萄糖和抗炎的特性，在心血管疾病和肥胖模型中显示出预防血脂异常，动脉粥样硬化和肥胖症的作用；川陈皮素具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化应激、减轻组织纤维化、降血压、降血糖、降血脂等多种作用；橘皮素可通过抑制erk1/2信号通路和mmp-2、mmp-9的表达延缓小鼠动脉瘤的进展。上述化学成分被认为是陈皮中的主要活性成分，能全面科学地反映中药陈皮的内在质量。