食品中大豆异黄酮总量的测定方法

本发明属于分析检测，具体涉及含大豆蛋白类食品中大豆异黄酮总量的测定。

背景技术：

1、大豆异黄酮主要来源于豆科植物的荚豆类，其结构与雌激素相似，因而在体内吸收后可与雌激素受体结合并产生雌激素样活性。正是由于具有类雌激素作用，大豆异黄酮又被称为植物雌激素，并用于改善更年期综合症。此外，有研究表明，大豆异黄酮具有抗氧化、预防肥胖、预防糖尿病、降低癌症风险、降低血糖及防止骨质酥松的作用，因而在保健品行业被广泛推广。但是过量摄入大豆异黄酮也会带来负面影响，特别是对于使用豆基配方食品的婴儿。

2、作为gb 10765-2021(食品安全国家标准婴儿配方食品)豆基婴儿配方食品中允许的并且是唯一的主要蛋白质来源，大豆来源的大豆分离蛋白往往残留有一定量的大豆异黄酮。由于缺少相关数据，以往认为使用豆基婴儿配方食品是安全的，然而，近年来最新的研究表明，当婴儿在发育敏感窗口期暴露在一定浓度水平的大豆异黄酮下，其产生的雌激素样作用将对生殖系统发育产生不良影响，并具有成年后引发相关疾病的风险。考虑到大豆及其制品在中国及其它亚洲国家有着普遍的食用习惯，同时由于大豆分离蛋白作为可替代动物蛋白的少数植物蛋白而被广泛用于食品工业及膳食补充剂，因此过量摄入植物雌激素的风险与日俱增，而准确快速的测定食品中大豆异黄酮含量不但为消费者提供合理的饮食指导，而且能促进大豆深加工产业链的发展。低异黄酮残留的大豆分离蛋白也将进一步保障豆基婴儿配方食品的使用安全性。

3、大豆异黄酮可以分为两类：一类为游离型苷元，包括大豆苷元、黄豆黄素、染料木素；另一类为结合型，苷元分别结合葡萄糖基、葡萄糖乙酰基及葡萄糖丙二酰基。以上游离型和结合型共计12种，其中结合型在大豆中约占总异黄酮的97％-98％。由于乙酰类及丙二酰类异黄酮苷稳定性差，故难以获取相应的标准品，进而造成了该类异黄酮定量的困难。因此，多数方法仅检测其中的3种苷元(大豆苷元、黄豆黄素、染料木素)及3种苷(大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷)，从而无法真实反映样品中实际大豆异黄酮的含量水平。

4、美国分析化学家协会(aoac)和美国药典(usp)收载的大豆异黄酮测定方法均采用了标准图谱比对法，并通过引入“转换因子”的方式以大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷为标准品对乙酰类及丙二酰类大豆异黄酮苷进行定量检测，但是采用上述方法需要确保色谱条件的充分一致性，包括色谱柱的规格、品牌的选择，以保证获得相对一致的保留时间，当样品基质复杂时往往引起较大的结果偏差。其它方法如aoac 2001.10通过皂化的方式将乙酰类及丙二酰类大豆异黄酮苷进行水解，以此获得相应的大豆苷、黄豆黄苷及染料木苷，并用六个标准品进行定量。该方法能比较准确地测定异黄酮的总量，但对含量较低的样品其测定偏差较大。

5、目前国内标准方法有gb/t 23788-2009《保健食品中大豆异黄酮的测定方法高效液相色谱法》及qb/t 5397-2019《大豆食品中异黄酮含量的测定》，两种方法均以高效液相色谱结合紫外检测的方式测定样品中3种苷元(大豆苷元、大豆黄素、染料木素)和3种苷(大豆苷、黄豆苷、染料木苷)。由于普遍采用甲醇水等极性混合溶剂通过振荡或超声的方式进行提取，同时也由于缺乏乙酰类及丙二酰类大豆异黄酮苷标准品，这就造成无法对另外6类主要异黄酮进行有效测定，从而使测定结果较真实结果偏低。

6、鉴于以上方法的局限性及不准确性，有必要开发并建立一种能真实反映样品中大豆异黄酮含量水平的测定方法，并具备准确、简便、快速的特点。

7、基于上述研究，本发明旨在实现大豆类相关食品中总异黄酮的准确测定，为食品发展及食品安全监管提供有力的技术支撑。

技术实现思路

1、发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供了一种食品中大豆异黄酮总量的测定方法，通过碱性条件下提取，结合葡萄糖苷酶的水解作用，可以实现样品中的各类异黄酮苷定量转化为相应的苷元；超高效液相色谱串联三重四极杆质谱法的运用可以实现样品中低浓度大豆异黄酮的测定并有效缩短检测周期。

2、技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

3、一种食品中大豆异黄酮总量的测定方法，包括以下步骤：

4、s1、待测样品使用碱性甲醇溶液进行提取处理，得提取液；

5、s2、所述提取液中加入β-葡萄糖苷酶进行酶解，实现转化后加入纯甲醇混合溶解，得测试液；

6、s3、所述测试溶液经超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱进行检测，获得待测样品中异黄酮类化合物的含量，所述异黄酮类化合物包括大豆苷元、黄豆黄素及染料木素。

7、本技术测定方法的原理为：待测样品(本技术中也称作试样)经碱性甲醇溶液提取，提取过程中试样中丙二酰及乙酰类大豆异黄酮苷分子上的酰基被水解，并转变为相应的异黄酮苷(大豆苷、黄豆黄苷及染料木苷)，提取液在酸性缓冲溶液中经β-葡萄糖苷酶酶解，各类异黄酮苷分子上的葡萄糖基被水解去除，溶液中所有的异黄酮苷均转变为相应的苷元(大豆苷元、黄豆黄素、染料木素)；酶解液用纯甲醇混合并稀释后经反相色谱柱分离，高效液相色谱串联质谱检测，以外标法定量。

8、可选的，在一种实施方式中，步骤s1中，所述碱性甲醇溶液为含有3g/l氢氧化钠的80％甲醇水溶液。

9、可选的，在一种实施方式中，所述提取处理包括，在含总大豆异黄酮50-500ug的待测样品中加入80ml碱性甲醇溶液，超声提取20min，加入4ml冰醋酸中和后用80％甲醇溶液定容至100ml。

10、可选的，在一种实施方式中，步骤s1中，所述待测样品中异黄酮总量的范围以苷元计为50ug-500μg。

11、可选的，在一种实施方式中，步骤s2具体包括，所述提取液1体积当量与4体积当量含5个活性单位葡萄糖苷酶的醋酸缓冲液混匀，在50℃水浴条件下振摇酶解120min，冷却，用甲醇定容至10体积当量。

12、进一步可选的，在一种实施方式中，步骤s2中，所述醋酸缓冲液的浓度为0.1mol/l,ph＝5.0。

13、可选的，在一种实施方式中，步骤s2中，所述酶解样品溶液用0.2μm的聚丙烯(pp)滤头过滤后备用。

14、可选的，在一种实施方式中，步骤s3中，所述超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱中的液相色谱的检测条件包括：

15、色谱柱：c18柱，50mm×2.1mm，1.8μm，或等效亚2微米超高效色谱柱。

16、可选的，在一种实施方式中，液相色谱的其他检测条件还包括：

17、流动相：a相，0.1％(v/v)甲酸溶液；b相，含0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液；

18、梯度洗脱：0min～12.0min，92％～75％ a；12.0min～13.0min，75％ a；13.0min～13.1min，75％～92％ a；13.1min～15.0min，92％ a；

19、流速：0.4ml/min；

20、柱温：40℃；

21、进样体积：1μl。

22、可选的，在一种实施方式中，步骤s3中，所述高效液相色谱-串联三重四级杆质谱中的质谱条件包括：电喷雾离子源、esi+正离子。

23、可选的，在一种实施方式中，质谱条件还包括：

24、干燥气温度：300℃；

25、干燥气流速：10l/min；

26、雾化器压力：20psi；

27、鞘气温度：250℃；

28、鞘气流速：11l/min；

29、毛细管电压：2000v。

30、可选的，在一种实施方式中，步骤s3中，所述高效液相色谱-串联三重四级杆质谱采用多重反应监测(mrm)模式，所述异黄酮类化合物的选择离子参数条件包括：

31、大豆苷元，保留时间为9±0.5min，母离子255.1m/z，子离子199.1m/z，毛细管加速电压4v，碰撞能量26v；

32、黄豆黄素，保留时间为10±0.5min，母离子285.1m/z，子离子270.1m/z，毛细管加速电压4v，碰撞能量30v；

33、染料木素，保留时间为12±0.5min，母离子271.1m/z，子离子215.1m/z，毛细管加速电压4v，碰撞能量30v。

34、可选的，在一种实施方式中，步骤s3中检测处理具体包括以下步骤：

35、s31、制作标准曲线

36、取异黄酮组分大豆苷元、黄豆黄素、染料木素的标准品分别溶于纯甲醇中，作为标准溶液，并用80％甲醇溶液配制成不同的梯度浓度，将标准系列溶液由低浓度到高浓度依次注入液相色谱-串联质谱仪中，测定相应的峰面积，以标准工作液中各异黄酮浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；

37、s32、异黄酮组分测定

38、取步骤s2所得测试液注入超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱中进行检测，得到相应的峰面积，根据标准曲线得到待测液中各异黄酮浓度。

39、可选的，在一种实施方式中，步骤s31中，所述标准溶液的配制方法包括：

40、s311、大豆异黄酮标准品溶于纯甲醇中，得100μg/ml的大豆异黄酮标准储备液；

41、s312、大豆异黄酮标准储备液溶于80％甲醇溶液中，得5-10μg/ml的大豆异黄酮标准中间液；

42、s313、大豆异黄酮标准中间液溶于80％甲醇溶液中，得0.05-0.5μg/ml的大豆异黄酮混合标准溶液。

43、可选的，在一种实施方式中，步骤s312中，所述大豆苷元标准中间液为5μg/ml，黄豆黄素标准中间液为5μg/ml，所述染料木素标准中间液为10μg/ml。

44、可选的，在一种实施方式中，步骤s313中，所述大豆异黄酮混合标准溶液中大豆苷元浓度为0.2μg/ml，黄豆黄素浓度为0.05μg/ml，染料木素浓度为0.5μg/ml。

45、可选的，在一种实施方式中，试样中大豆异黄酮各组分(大豆苷元(x1)、黄豆黄素(x2)、染料木素(x3))的含量按公式(1)计算：

46、

47、式中：

48、xi——试样中大豆异黄酮单一组分的含量，单位为毫克每克(mg/g)或毫克每毫升(mg/ml)；

49、ci——根据标准工作曲线获得各异黄酮的浓度，单位为微克每毫升(μg/ml)；

50、v——试样稀释总体积，单位为毫升(ml)；

51、m——试样质量，单位为克(g)。

52、可选的，在一种实施方式中，试样中大豆异黄酮总含量，按公式(2)计算：

53、x＝x1+x2+x3   (2)

54、式中：

55、x——试样中大豆异黄酮总含量，单位为毫克每克(mg/g)或毫克每毫升(mg/ml)；

56、x1——试样大豆苷元的含量，单位为毫克每克(mg/g)或毫克每毫升(mg/ml)；

57、x2——试样黄豆黄素的含量，单位为毫克每克(mg/g)或毫克每毫升(mg/ml)；

58、x3——试样染料木素的含量，单位为毫克每克(mg/g)或毫克每毫升(mg/ml)。

59、本技术提供了食品中大豆异黄酮总量的测定方法，适用于含大豆异黄酮成分的食品，包括以大豆异黄酮为主要功能性成分添加或添加有大豆分离蛋白的保健食品、豆基婴幼儿配方食品中大豆异黄酮的测定。

60、有益效果：本发明采用超高效液相色谱串联三重四极杆质谱法测定食品中大豆异黄酮总量的方法，具有以下优势：

61、(1)由于异黄酮中的糖苷型具有亲水性及分子量相对较大的特点，其进入人体后很难被直接吸收，当大豆异黄酮苷进入人体后则在肠道葡萄糖苷酶的作用下水解为苷元并在小肠迅速吸收进而表现出其生物活性，因而检测样品中苷元的总量则显得更具科学性。

62、(2)检测目标物的减少将有助于缩短仪器运行时间并降低检测成本。通过碱性条件下提取结合葡萄糖苷酶的水解作用，可以实现样品中的各类异黄酮苷定量转化为相应的苷元。超高效液相色谱串联三重四极杆质谱法的运用可以实现样品中低浓度大豆异黄酮的测定并有效消除样品基质干扰。

63、(3)由于仅使用3类大豆异黄酮苷元就实现了对12种大豆异黄酮总量的测定，对于标准品的使用费用在原先最少需要使用6种异黄酮标准品的基础上减少为仅为原来的1/3。

64、(4)总大豆异黄酮以苷元计，一方面能更准确地体现实际生物活性水平；另一方面也可以避免因使用苷或苷元的不统一而造成结果表述的差异。

65、(5)方法学研究表明，该方法具有较低的检出限及较高的准确度。