一种同时检测血液中6种药物浓度的方法与流程

本公开涉及药物检测，尤其涉及一种同时检测血液中6种药物浓度的方法。

背景技术：

1、帕金森病又称震颤麻痹，是一种中枢神经系统椎体外系功能障碍的慢性进行性疾病。卡比多巴是一种外周脱羧酶抑制剂，不易进入神经中枢，与左旋多巴合用治疗帕金森病可以抑制外周左旋多巴转化为多巴胺，使进入神经中枢的左旋多巴逐渐增加，进而减少左旋多巴对周围心血管的不良反应，另外，左旋多巴代谢物3-甲氧基多巴也有较强活性。

2、多巴胺是一种脑内分泌物，是大脑中含量最丰富的儿茶酚胺类神经递质，能够调控中枢神经系统的多种生理功能，多巴胺系统调节障碍可能会导致帕金森病、精神分裂症、注意力缺陷多动综合征或垂体肿瘤的发生等。

3、卡巴拉汀属第二代中枢ache抑制药，对大脑皮层和海马的ache有选择性抑制作用，而对纹状体和心脏的ache几乎无影响，且可减慢淀粉样蛋白前体（app）的形成。口服迅速吸收，约1h达到cmax，血浆蛋白结合率约40%，已透过血脑屏障，临床用于轻、中度ad，改善认知功能障碍，提高记忆力、注意力和方位感。

4、美金刚主要作用于脑内谷氨酸神经递质系统，通过与nmda受体作用降低背景噪声，使谷酰胺信号恢复至正常生理状态。

5、监测以上药物的血药浓度，对开展与原研药的生物等效性研究具有重要意义。目前已知的对血液中卡比多巴、多巴胺、美金刚、卡巴拉汀、左旋多巴及其代谢物含量通常均是采用高效液相色谱质谱联用的方法对上述药物分别进行检测，并没有关于如何实现卡比多巴、多巴胺、美金刚、卡巴拉汀、左旋多巴及其代谢物（3-甲氧基多巴）同时检测的方法的存在。且目前提供的检测方法中，一般存在样品量需求较大、样品前处理条件复杂、样本稳定性差、同类药物检测方法差异大、检测难度大检测效率低等问题，尚不适于大通量的样本检测。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本公开提供了一种同时检测血液中6种药物浓度的方法。本公开提供的检测方法在满足检测要求的前提下，能够减少样品用量，延长样本稳定性，降低检测难度，提高检测效率。

2、第一方面，本公开提供了一种同时检测血液中6种药物浓度的方法，所述方法包括：

3、（1）配制至少三种不同浓度的含有6种药物及其内标物的标准溶液，并利用液相色谱-质谱对所述标准溶液进行检测，根据检测结果分别建立所述6种药物的标准曲线；

4、（2）将待测样品与稳定剂混合保存备用，待测试之前，混合液与内标物混合、离心，取上清液作为进样样品；

5、（3）利用液相色谱-质谱对所述进样样品进行检测，根据检测结果和所述标准曲线确定所述待测样品中6种药物的含量；

6、其中，所述6种药物为卡比多巴、多巴胺、美金刚、卡巴拉汀、左旋多巴和3-甲氧基多巴。

7、本公开提供的检测方法能够一针测得6种药物的含量，检测时间短，在5.5 min以内出结果，提高检测效率的同时降低操作难度，适用于高通量样本的检测。

8、本公开待测样品中添加同位素内标物经稳定剂沉淀蛋白后取上清液直接进样，检测过程简便快速，分析时间短；另外通过对待测样品中添加稳定剂能够延长其稳定时间更利于大通量的样本检测。

9、作为本公开的一种优选技术方案，所述稳定剂为含有5-10%酸类化合物（例如6%、7%、8%、9%等）和5-15%焦亚硫酸钠的水溶液（例如6%、8%、10%、12%、14%等），所述酸类化合物选自高氯酸、磺基水杨酸或三氯乙酸。

10、卡比多巴、多巴胺、卡巴拉汀、左旋多巴等在血清/血浆中均不稳定，利用本公开提供的稳定剂处理后的样品更加稳定，常温可保存24 h，4℃可保存48 h，降低样品运输要求和运输成本，提取回收率高，基质效应小，而且操作简单易行。

11、作为本公开的一种优选技术方案，所述待测样品和稳定剂的体积比为1:(1-3)，例如1:1.5、1:2、1:2.5等。

12、作为本公开的一种优选技术方案，所述液相色谱的条件包括：

13、流动相：a相为含有0.2-3%甲酸、1-10 mmol/l甲酸铵或乙酸铵的水溶液，b相为乙腈；

14、梯度洗脱：

15、0.00 min：a相98-80%，b相2-20%；

16、0.50 min：a相98-80%，b相2-20%；

17、0.60 min：a相60-40%，b相40-60%；

18、1.00 min：a相60-40%，b相40-60%；

19、1.10 min：a相5-15%，b相95-85%；

20、2.50 min：a相5-15%，b相95-85%；

21、3.00 min：a相98-80%，b相2-20%；

22、5.50 min：a相98-80%，b相2-20%。

23、所述0.2-3%甲酸可以为0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%等；所述1-10mmol/l可以为2mmol/l、4 mmol/l、6 mmol/l、8 mmol/l等。

24、在梯度洗脱条件中，对于0.00-0.50 min，a相可以为96%、94%、90%、85%等，b相可以为3%、5%、10%、15%等。对于0.60-1.00 min，a相可以为58%、55%、52%、50%、48%、45%、42%等，b相可以为42%、45%、48%、50%、52%、55%、58%等。对于1.10-2.50 min，a相可以为6%、8%、10%、12%、13%、14%等，b相可以为94%、92%、90%、88%、87%、86%等。对于3.00-5.50 min，a相可以为96%、94%、90%、85%等，b相可以为3%、5%、10%、15%等。

25、作为本公开的一种优选技术方案，柱温为35-40℃，例如36℃、37℃、38℃、39℃等。

26、作为本公开的一种优选技术方案，所述流动相的流速为0.3-0.5ml/min，例如0.35ml/min、0.4 ml/min、0.45 ml/min等。

27、作为本公开的一种优选技术方案，所述液相色谱的条件包括：使用的分析色谱柱为agilent poroshell 120 ec-c18、phenomenex kinetex f5。

28、本公开通过对液相条件的优化，如流动相的选择（水相中盐浓度及酸浓度的选择、有机相的选择等）、梯度洗脱程序优化及色谱柱的选择使卡比多巴、多巴胺、美金刚、卡巴拉汀、左旋多巴及其代谢物3-甲氧基多巴得到良好的色谱峰形，且色谱分离，避免离子串扰并有效降低基质效应。

29、作为本公开的一种优选技术方案，所述质谱的条件包括：雾化气温度：300-400℃，雾化气气流：10-14 l/min，喷雾器：40-50psi，毛细管电压：4000-4500 v，电子倍增器电压值：300-350 v。

30、所述雾化气温度：300-400℃，可以为320℃、340℃、360℃、380℃等；所述雾化气气流：10-14 l/min，可以为11 l/min、12 l/min、13 l/min等；所述喷雾器：40-50 psi，可以为42 psi、44 psi、46 psi、48 psi等；所述毛细管电压：4000-4500 v，可以为4100 v、4200 v、4300 v、4400v等；所述电子倍增器电压值：300-350 v，可以为310 v、320 v、330v、340 v等。

31、作为本公开的一种优选技术方案，所述6种药物的内标物分别为卡比多巴-d3、多巴胺-d3、美金刚-d6、卡巴拉汀-d6、左旋多巴-d3和3-甲氧基多巴-d3。

32、作为本公开的一种优选技术方案，在步骤（2）中，所述内标物以内标工作液的形式与待测样品混合，所述内标工作液为含有所述6种药物的内标物的溶液，所述待测样品和所述内标工作液的体积比为(5-10):1，例如6:1、7:1、8:1、9:1等。

33、作为本公开的一种优选技术方案，在步骤（2）中，所述待测样品为血浆或血清。

34、作为本公开的一种优选技术方案，所述标准溶液的制备方法包括：制备至少三个级别浓度的标准工作液，标准工作液、内标工作液和蛋白沉淀剂混合，取上清液为所述标准溶液，所述蛋白沉淀剂为含有5-10%酸类化合物的水溶液，所述酸类化合物选自高氯酸、磺基水杨酸或三氯乙酸。

35、所述含有5-10%酸类化合物的水溶液可以是6%、7%、8%、9%等，所述含有5-10%磺基水杨酸的水溶液可以是6%、7%、8%、9%等。

36、为了使建立的标曲更能符合待测样品的检测，准确性更高，因此，本公开所述标准溶液的制备方法参照待测样品的前处理方法进行，由于标准工作液中已经含有稀释剂i，即已经含有焦亚硫酸钠，因此此处只添加蛋白沉淀剂酸类化合物即可（此处使用的蛋白沉淀剂中酸类化合物的种类和浓度与样品前处理中稳定剂中酸类化合物的种类和浓度相同）。焦亚硫酸钠和酸类化合物配合使用能够减少杂质干扰、降低残留、降低基质效应，使得到的标准曲线更加稳定。

37、作为本公开的一种优选技术方案，各所述级别浓度的标准工作液均利用稀释剂i由标准中间液稀释得到，所述标准中间液利用稀释剂i由标准品储备液稀释得到，所述标准品储备液是利用溶剂分别溶解所述6种药物各自的标准品得到。

38、作为本公开的一种优选技术方案，所述内标工作液利用稀释剂ii由内标中间液稀释得到，所述内标中间液利用稀释剂ii由内标储备液稀释得到，所述内标储备液是利用溶剂分别溶解所述6种药物各自的内标物标准品得到。

39、在本公开中，部分药物可以直接由储备液制备得到工作液，则此时，无需制备中间液。

40、作为本公开的一种优选技术方案，所述稀释剂i为含有焦亚硫酸钠的甲醇水溶液，所述甲醇水溶液的浓度为5-15%，例如6%、8%、10%、12%、14%等。

41、本公开稀释剂i中含有焦亚硫酸钠，所述焦亚硫酸钠的浓度为5-15%，例如6%、8%、10%、12%、14%等，优选为10%。本公开利用稀释剂i对标准品储备液进行稀释，能够使得到的标准中间液更加稳定，存储稳定性高，无需现用现配，且得到的标准曲线也更加稳定。

42、作为本公开的一种优选技术方案，所述稀释剂ii为浓度为65-75%的甲醇水溶液，所述65-75%可以为66%、68%、70%、72%、74%等。

43、本公开实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：

44、1、本公开提供的检测方法能够一针测得6种药物的含量，检测时间短，在5.5 min以内出结果，提高检测效率的同时降低操作难度，适用于高通量样本的检测。

45、2、本公开提供的检测方法通过对流动相、洗脱梯度、色谱柱的优化使药物有效分离避免离子串扰，结合特定的酸类化合物和焦亚硫酸钠，能够减少杂质干扰、降低残留、降低基质效应，使待测样品和标准曲线更加稳定，提高了检测结果的准确度。

46、3、本公开提供样品前处理的方法中的稳定剂中含有焦亚硫酸钠，能够使待测样品更加稳定，常温可保存24 h，4℃可保存48 h，降低样品运输要求和运输成本。