一种人体血浆抗肝癌哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂串联质谱检测试剂盒的制作方法

本发明涉及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂的定量检测，超高效液相色谱串联质谱联用检测人血浆中抗肝癌靶向药的方法，具体是一种人体血浆哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂检测成品试剂盒。

背景技术：

1、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mtor)是一种大分子蛋白质，是一类进化上非常保守的蛋白激酶家族，广泛存在于各种生物细胞中，直接或间接地参与了多个与细胞增殖和生长有关的环节的调控，被认为是细胞生长增殖的中心调控者pi3k/akt/mtor信号通路在多种肿瘤细胞中有异常表达，与肿瘤的增殖与血管形成密切相关。阻断该信号通路，特别是抑制mtor的活化，有可能特异地抑制肿瘤细胞的生长。肝癌是常见的恶性肿瘤，且具有发病隐匿，进展快，复发早和预后差等临床特点，其发病率和死亡率一直居高不下。近来发现，mtor拮抗剂与雄激素受体拮抗剂联合使用对治疗肝癌具有协同作用,这两种药物组合的疗效值得进一步检验。依维莫司是由瑞士诺华公司研发的一种雷帕霉素的衍生物，是一种口服的mtor抑制剂，研究表明，mtor和s6k在15％～41％的hcc中过表达，该药对多种肝癌细胞株和移植瘤有抑制作用，能减慢肿瘤生长。这类药物血药浓度与免疫抑制的程度有关，也与肝肾的毒性密切相关。肝癌患者在药物治疗时由于耐药性和药物毒性治疗失败的病例时常被报道，而且由于影响该类药物吸收的因素较多，个体差异大，因此有必要在临床进行血药浓度监测，以便及时调整给药剂量，提高药物疗效和安全性。

2、血浆中mtor抑制剂的测定可以定量肝癌患者体内治疗药物的浓度，从而结合患者实际情况调整给药剂量。第一代mtor抑制剂包括雷帕霉素及其衍生物。第二代mtor抑制剂包括atp竞争性mtor激酶抑制剂pi3k/mtor双重抑制剂、选择性mtorc1/mtorc2抑制剂(如azd8055)等。研究发现，在体外，azd8055可抑制人肝癌细胞的生长，阻滞细胞周期于g0/g1期并诱导细胞凋亡。除此之外，维妥色替、pictilisib、依维莫司、替西罗莫司也被证实对肝癌细胞有抑制作用。建立同时检测肝癌患者血浆中5种mtor抑制剂的方法，对临床治疗药物监测具有重要意义。

3、目前有关这类药物的血药浓度测定方法以hplc法和免疫法(fpia)为主，hplc法操作较为繁琐，分析时间较长，而且灵敏度不高。免疫分析法存在一定的局限性，即药物体内代谢产物易干扰原形药物的检测。随着高效液相色谱串联质谱仪的普及，lc-ms/ms法由于其精密度、准确度及灵敏度方面的巨大优势，而且可同时定量分析生物基质的多种物质，逐渐广泛应用于药代动力学研究各个领域。但检测时需要样品有良好的基质效应，因此需要选择合适的前处理技术，以提高净化效率，减小杂质影响。基于mtor抑制剂的检测，常用的前处理技术有蛋白质沉淀法(pp),液液萃取(lle),盐析辅助液液萃取(salle),固相萃取(spe)等，而quechers是由分散固相萃取(dspe)衍生出的一种新兴的前处理技术，最初用于农药残留领域，近年来，随着该技术的改良和发展，逐渐应用于血浆和尿液等生物基质中代谢物和其他化合物的分析。

4、因此，临床检测亟需一种不仅具备高灵敏度，高特异性，高准确度检测结果，还可以同时检测多种具有抗肝癌作用的mtor抑制剂，并拥有操作简单方便，容易推广的mtor抑制剂直接检测方法及试剂盒，以减小基质效应和化合物不稳定性对实验结果的影响，从而提高临床检测质量。

技术实现思路

1、鉴于现有技术中的上述缺陷或不足，本发明为了解决上述现有技术中存在的问题，提供了一种可以全面检测肝癌患者血浆中mtor抑制剂含量的试剂盒，并且能够有效降低基质干扰，提高净化效率和检测准确性，操作简便，可同时检测mtor抑制剂。

2、其主要技术方案为：一种人体血浆抗肝癌哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂串联质谱检测试剂盒，该试剂盒包括校准品、质控品、内标准液、解离剂、解离剂稀释液、流动相a液、流动相b液、复溶液、quechers前处理溶液、操作说明书及其分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，适用于超高效液相色谱-串联质谱仪。

3、试剂盒各组成成分及其配制方法分别如下：

4、1)校准品：使用甲醇稀释液，同时加入一定量标准品，配制成6个浓度剂量点的校准品a～f，即1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、80ng/ml(维妥色替、azd8055、pictilisib)；2.5ng/ml、5ng/ml、12.5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、200ng/ml(依维莫司)；10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、800ng/ml(替西罗莫司)冻干后使用；

5、2)质控品：使用甲醇稀释液，同时加入一定量的标准品，配制成3个浓度的质控品c1～c3，即2ng/ml、20ng/ml、80ng/ml(维妥色替、azd8055、pictilisib)；5ng/ml、50ng/ml、200ng/ml(依维莫司)；20ng/ml、200ng/ml、800ng/ml(替西罗莫司)冻干后使用；

6、3)内标准液：使用甲醇作为稀释液，将他克莫司稀释至终浓度为50ng/ml，冻干后使用；

7、4)流动相a：由甲酸、乙酸铵与甲醇制成，甲酸的含量为0.05％～0.2％，乙酸铵含量为2-5mmol/l；

8、5)流动相b：由乙酸铵、甲酸与纯化水配制而成，甲酸的含量为0.05％～0.2％,乙酸铵含量为2-5mmol/l；

9、6)复溶液：由甲醇与纯化水配制而成，甲醇含量为50％-100％；

10、7)quechers净化材料：20mg-40mg c18，用隔水包装袋封装；

11、8)盐析剂：250-400mg无水硫酸镁，用隔水包装袋封装；

12、9)提取剂：1ml-3ml乙腈；

13、进一步的，所述乙腈、甲酸和甲醇均为质谱级试剂；所述提取剂中乙腈的用量为1ml；所述c18的用量为30mg；所述盐析剂中无水硫酸镁的用量为400mg；所述流动相a、流动相b中的含乙酸铵量为2mmol/l；所述复溶液中甲醇的含量为100％；甲酸的含量优选0.1％。

14、人体血浆抗肝癌哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂串联质谱检测试剂盒的使用包括以下步骤：

15、1)准备工作液：通过甲醇分别稀释试剂盒中的校准品、质控品、内标准品，分别制成校准品工作液、质控品工作液、内标工作液，以满足样品处理所需；

16、2)样品前处理：取100μl的血浆样品依次加入提取剂、quechers净化材料和盐析剂，混合均匀；加入一定量的内标工作液，离心分离上清液后氮气室温彻底吹干，加入500μl复溶液至溶解完全；

17、3)移液：从步骤2)将200μl溶液转移到进样小瓶；

18、4)设置色谱和质谱条件：根据实际仪器型号分别设置超高效液相色谱和串联质谱仪的工作参数和条件；

19、5)样品检测：将处理好的校准品、质控品和血浆样品各5μl注入高超效液相色谱-串联质谱仪进行检测分析，并记录色谱图与检测样品中维妥色替、azd8055、pictilisib、依维莫司、替西罗莫司的峰面积与内标峰面积；

20、6)结果分析：绘制标准曲线和计算曲线回归方程，计算出样品维妥色替、azd8055、pictilisib、依维莫司、替西罗莫司的浓度。

21、进一步的，所述步骤1)中具体的：将冻干的校准品和质控品用纯化水溶解成工作液；按照内标准品∶甲醇＝1∶99配制成内标准品工作液；

22、进一步的，所述步骤5)中的色谱条件为：

23、色谱柱：extend-c18 rrhd(2.1mm×50mm,1.8μm)，流速：0.3ml/min，

24、柱温：40℃，

25、进样量：5μl，

26、梯度洗脱条件：

27、

28、质谱条件为：

29、esi正离子srm扫描模式，

30、喷雾电压：4000v，

31、鞘气流速：40arb，

32、辅助气流速：15arb，

33、离子传输管温度：350℃，

34、雾化温度：350℃，碰撞气：氩气，

35、压力：1.5mtorr；

36、q1/q3离子通道分别选择为

37、azd8055：466.25→334.10，450.20amu；

38、pictilisib：514.10→294.05，338.10amu；

39、维妥色替：463.20→347.12，405.10amu；

40、依维莫司：975.50→890.5，908.50amu；

41、替西罗莫司：1047.50→930.53，980.50amu。

42、本发明具有以下特点：

43、1、本试剂盒已经含有人体血浆中mtor抑制剂检测串联质谱法所需的主要配套试剂和耗材，并且简化了实验操作步骤，从而能使临床检测更加简便快捷，大大减少试剂耗材的单独购买和自行配制试剂带来的操作误差。

44、2、本试剂盒使用的检测方法为超高效液相色谱串联质谱法，根据分析物固有的理化性质进行直接检测血浆中的5种mtor抑制剂，能够有效去除临床血样的基质效应，提高净化效率，并且能够准确的定量出各个分析物质在体内的情况。

45、3、本试剂盒使用超高效液相色谱串联质谱仪进行检测，采用quechers方法进行前处理，与背景技术介绍的传统前处理方法相比，本试剂盒可同时快速准确检测出人体血浆中维妥色替、azd8055、pictilisib、依维莫司、替西罗莫司5类物质，从而更加清楚的反映患者体内治疗药物的浓度。