一种用于mRNA疫苗中polyA尾检测的方法及应用与流程

本发明涉及药物分析，尤其涉及ipc g01n30，更具体地涉及，一种用于mrna疫苗中polya尾检测的方法及应用。

背景技术：

1、“疫苗”一词成为全民关注的焦点，各种创新技术用于疫苗的开发。其中，mrna疫苗作为未来最具潜力的疫苗，未来主要发展方向不仅在于常见的预防性疫苗，还包括较好前景的治疗性疫苗。

2、mrna又被称为信使核糖核酸，在真核生物中，mrna在转录后会经过一系列的修饰，在5’端形成一个特殊结构，即帽子结构，3’端形成polya尾结构。体内转录后修饰中，polya聚合酶在rna 3’-oh上逐一引入100-200个a碱基，影响着成熟mrna的稳定性、翻译起始以及出核运输。

3、据文献报道，poly a尾部长度的表征方法有很多种，如hplc、pcr及二代测序等。hplc、pcr法分辨率低，二代测序虽分辨率最高，可检测出polya的分布范围，但因其需要进行rna扩增，故步骤繁琐。与上述方法有所不同，质谱法(ms)可直接检测，能够通过分子量差异分辨单个核苷酸，同时可检测多个寡核苷酸序列，已被作于一种诊断平台。

4、爱必信(上海)生物科技有限公司公开了一种mrna质量检测之poly a尾检测方法，基于内切酶和lc-ms平台的polya尾检测，但其中的溶剂和操作所得到的polya尾检测结果的分辨率较低。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中的问题，本发明第一方面提供了一种省时、省力、分辨率高的用于mrna疫苗中polya 尾检测的方法，包括以下步骤：

2、s1：对mrna疫苗溶液中的mrna进行酶切、磁珠纯化、洗脱回收，得到polya尾片段；

3、s2：利用液相色谱质谱联用仪lc-ms对poly a尾片段进行检测；其中lc-ms中液相色谱的流动相由水相a相和有机相b相组成；所述的a相包括六氟异丙醇和n,n-二异丙基乙胺和水；所述b相包括纯甲醇；质谱扫描采用负离子模式。

4、优选的，所述酶切的步骤为使用rnase t1酶对mrna疫苗溶液中的mrna进行酶切。

5、优选的，所述酶切的具体步骤为将mrna疫苗溶液在90～100℃加热3～8min，然后放置在冰上迅速降温至室温；再加入10x rnase h buffer和rnase t1，混匀后于35～40℃反应3～3.5h。

6、优选的，所述mrna疫苗溶液的体积为100～150μl。

7、优选的，所述磁珠纯化的步骤为使用结合缓冲液清洗磁珠，再加入酶切处理后的mrna疫苗溶液，收集磁珠，弃去液体。

8、优选的，所述磁珠和mrna用量比例为1g：(100～500)；进一步优选的，为1g：300pmol。

9、优选的，所述结合缓冲液包括30～50v/v％40～60mm tris-hcl、20～30v/v％3～8m licl、1～3v/v％3～8m edta、17～49v/v％水；进一步优选的，包括40v/v％50mm tris-hcl、25v/v％5m licl、2v/v％0.1m edta、33v/v％水。

10、优选的，所述洗脱回收的步骤为，向纯化后的磁珠中陆续加入清洗缓冲液、乙酸铵及质量分数为75％的甲醇溶液添加到磁珠中，洗脱后收集滤液得到polya片段。

11、优选的，所述清洗缓冲液包括20～30v/v％40～60mm tris-hcl、1～5v/v％2～8mlicl、0.1～3v/v％0.01～1m edta、62～78.9v/v％水；进一步优选的，包括25v/v％50mmtris-hcl、3v/v％5m licl、1v/v％0.1m edta、69v/v％水。

12、优选的，所述质量分数为75％的甲醇溶液的温度为80℃。

13、本发明中，通过选用30～50v/v％40～60mm tris-hcl、20～30v/v％3～8mlicl、1～3v/v％3～8m edta、17～49v/v％水的结合缓冲液和20～30v/v％40～60mm tris-hcl、1～5v/v％2～8m licl、0.1～3v/v％0.01～1m edta、62～78.9v/v％水的清洗缓冲液，在提高提高了polya尾的纯度的同时，减少对后续操作的影响，提高了lc-ms结果测定的灵敏度和分辨率。本发明人发现，现在常用的洗脱poly尾的缓冲液为0.1m的醋酸铵溶液，但用0.1m的醋酸铵溶液洗脱结合mrna疫苗中polya尾的磁珠，其结果图谱中存在噪音，结果无法清晰显示polya尾的分布。

14、在一种优选的方案中，所述用于mrna疫苗中polya 尾检测的方法，包括以下具体步骤：

15、步骤m1：酶切：取100～150μl mrna疫苗溶液在90～100℃加热3～8min，然后放置在冰上迅速降温至室温；再加入15～25μl 10x rnase h buffer和5～15μl rnase t1酶，混匀后于37℃反应3h；

16、步骤m2：磁珠纯化：移取磁珠溶液于离心管中，将其放在磁力架上静置后弃去液体；从磁力架中取出离心管，加入结合缓冲液后放在磁力架上静置，弃去液体，重复两次；向清洗后的磁珠中加100～200μl结合缓冲液和经过m1步骤处理后的mrna疫苗溶液，室温条件下震荡孵育10～20min后，置于磁力架上收集磁珠，弃液体；

17、步骤m3：洗脱回收：将步骤m2得到的磁珠中加100～200μl清洗缓冲液，置于磁力架上1～3min后，弃液体，重复两次；再加入100～200μl 100mm乙酸铵，置于磁力架上1～3min后，弃液体，重复三次；将80.0～120.0μl已加热至80℃的质量分数为75％甲醇添加到清洗后的磁珠中；在80℃条件下孵育5min，在磁力架上放置1～3min后，收集液体，在室温条件下冻干，得到冻干粉；

18、步骤m4：样品分析：将步骤m3得到的冻干粉中加入60.0～100.0μl 100μmedta溶液复溶，进行lc-ms分析，所述的水相包括六氟异丙醇和n,n-二异丙基乙胺和水；所述有机相包括纯甲醇；质谱扫描采用负离子模式。

19、本发明中还添加了100～200μl 100mm乙酸铵进行清洗，进一步溶解了磁珠上其它的杂质，提高了磁珠上polya尾的纯度，提高了lc-ms检测方法的灵敏度，提高了polya尾的响应率。

20、本发明中，采取将纯化的polya尾冻干，在使用时再进行复溶的操作，提高了lc-ms的响应值，从而提高了lc-ms的灵敏度。本发明人发现，相比于旋蒸旋干甲醇，通过将溶液冻干，使polya溶液中甲醇和水分挥发，既收集到高纯度的polya片段，有保持了polya片段的化学结构，从而提高了lc-ms的响应值，进而提高了lc-ms的灵敏度。

21、优选的，所述m4中的edta含1wt％的甲醇。

22、优选的，所述s2中的利用液相色谱质谱联用仪lc-ms对poly a尾片段进行检测时，其中液相色谱中的操作步骤如下：采用uplc系统进行分离，分析样品置于8℃自动进样器中，柱温75℃，流速为300μl/min，进样量45μl；相关液相色谱梯度设置如下：0-2min，b相维持在5％；2-10min，b相从5％线性变化至50％；10-10.5min，b相从50％线性变化至90％；10.5-12.5min，b相维持在90％；12.5-13.0min，b相从90％线性变化至5％；13.0-15.0min，b相维持在5％。

23、优选的，所述a相为2v/v％六氟异丙醇和0.1v/v％n,n-二异丙基乙胺和97.9v/v％水组成；

24、优选的，所述b相为纯甲醇。

25、本发明中，通过选用流动相中的a相为六氟异丙醇和n,n-二异丙基乙胺，使背景更干净、响应更高。本发明人发现，在利用lc-ms检测polya尾的方法中，常用的流动相中的a相为100mm的醋酸三乙胺，但使用醋酸三乙胺后的背景噪音较多，响应较低，影响最终的检测结果。本发明人推测，六氟异丙醇和n,n-二异丙基乙胺的混合溶液，其沸点和酸性更弱，在电喷雾离子化气相状态下更容易挥发，对寡核苷酸的离子化干扰更小，与电喷雾质谱更加兼容，从而导致检测结果中背景信噪减小，响应率提高。

26、优选的，所述s2中的利用液相色谱质谱联用仪lc-ms对poly a尾片段进行检测时，其中质谱的操作步骤如下：

27、采用acquity h-class plus xevo g2-xs质谱仪(waters)在负离子模式下进行质谱分析；条件如下：项目：系统设置；质量范围：400m/z～3000m/z；毛细管电压：2.5kv；锥孔电压：80v；脱溶剂温度：350℃；锥孔气大小：50l/h；脱溶剂大小：700l/h。

28、本发明第二方面提供了一种用于mrna疫苗中polya 尾检测的方法的应用，应用于构建mrna疫苗中polya 尾检测的方法系统和检测平台。

29、有益效果

30、1、本发明中，通过选用流动相中的a相为六氟异丙醇和n,n-二异丙基乙胺，使背景更干净、响应更高。

31、2、本发明中，通过选用30～50v/v％40～60mm tris-hcl、20～30v/v％3～8mlicl、1～3v/v％3～8m edta、17～49v/v％水的结合缓冲液和20～30v/v％40～60mm tris-hcl、1～5v/v％2～8m licl、0.1～3v/v％0.01～1m edta、62～78.9v/v％水的清洗缓冲液，在提高了polya尾的纯度的同时，减少对后续操作的影响，提高了lc-ms结果测定的灵敏度和分辨率。

32、3、本发明中，采取将纯化的polya尾冻干，在使用时再进行复溶的操作，提高了lc-ms的响应值，从而提高了lc-ms的灵敏度。

33、4、本发明中通过酶切、磁珠纯化、洗脱回收，可实现polya片段的富集，提高灵敏度，解决了因浓度低而无法检测的问题；

34、5、本发明中通过lc-ms检测分析可实现单个核苷酸的检测，可检测多个寡核苷酸序列，进而准确地确定polya分布范围，分辨率高；且前处理方法简单，检测时间短，大大提高稳定性，节省时间，可以作为mrna疫苗的常用表征。