一种化学发光分析方法及其应用与流程

本发明属于化学发光分析，具体涉及一种化学发光分析方法及其应用。

背景技术：

1、化学发光分析法是一种利用化学发光物质发射的光波进行检测的方法。化学发光物质作为标记应用于核酸检测与免疫检测中。例如，可通过多种途径将特异结合对中的某一分子与发光物质结合形成发光微球组合物。该微球组合物可与样品中被检测物(特异结合对中的另一分子)反应，分配于固相与液相中，且分配比例与检测物的量相关。通过测定固相或液相中发光量，即可得出样品中检测物的相应浓度。

2、目前随着检测行业的进步，对超敏试剂的需求越来越多，不但对灵敏度要求极高，而且线性范围又要求非常宽，现有的化学发光分析方法很难满足上述检测条件。

3、因此，亟需开发一种既能满足灵敏度要求、又能满足线性范围要求的化学发光分析方法。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种化学发光分析方法，该方法既有超高的灵敏度，又有很宽的检测量程。另外，该方法还能够缩短检测时间。

2、为此，本发明提供了一种化学发光分析方法，其通过检测待测样品中的至少两种不同粒径的受体微球与活性氧反应产生的化学发光信号强度来分析判断待测样品中是否包含待测目标分子和/或待测目标分子的浓度。

3、在本发明的一些实施方式中，所述方法通过检测待测样品中的两种不同粒径的受体微球与活性氧反应产生的化学发光信号强度来分析判断待测样品中是否包含待测目标分子和/或待测目标分子的浓度。

4、在本发明的一些实施方式中，所述两种不同粒径的受体微球的粒径差值不低于100nm；优选不低于150nm；更优选不低于200nm。

5、在本发明的另一些实施方式中，所述两种不同粒径的受体微球的粒径比选自1:(1.1-10)；优选选自1:(2-8)；更优选选自1:(3-6)。

6、在本发明的一些实施方式中，所述受体微球的使用浓度为1ug/ml-1000ug/ml；优选为10ug/ml-500ug/ml；更优选为10ug/ml-250ug/ml。

7、在本发明的一些实施方式中，所述待测样品中还包括供体微球，所述供体微球能够在激发状态下生成活性氧。

8、在本发明的另一些实施方式中，所述方法为均相化学发光分析方法。

9、在本发明的一些优选的实施方式中，所述方法包括以下步骤：

10、s1，将待测样本与包含至少两种不同粒径的受体微球的试剂a混合后，再与包含供体微球的试剂b混合，从而得到待测样品；

11、s2，利用能量或活性化学物与步骤s1中得到的待测样品接触，激发供体产生活性氧；

12、s3，通过检测待测样品中的至少两种不同粒径的受体微球与活性氧反应产生的化学发光信号强度来分析判断待测样品中是否包含待测目标分子和/或待测目标分子的浓度。

13、在本发明的一些实施方式中，所述待测样本利用稀释液稀释后再进行反应。

14、在本发明的一些实施方式中，所述方法通过检测待测样品中的三种不同粒径的受体微球与活性氧反应产生的化学发光信号强度来分析判断待测样品中是否包含待测目标分子和/或待测目标分子的浓度。

15、在本发明的一些实施方式中，所述化学发光信号的检测波长为520～620nm。

16、在本发明的另一些实施方式中，采用600～700nm的红色激发光进行激光照射。

17、在本发明的一些实施方式中，所述受体微球包括发光组合物和基质，所述发光组合物填充于基质中和/或包被于基质表面。

18、在本发明的一些优选的实施方式中，所述发光组合物能够与活性氧反应产生可检测的化学发光信号，其包含化学发光化合物和金属螯合物。

19、在本发明的一些具体实施方式中，所述化学发光化合物选自烯烃化合物，优选选自二甲基噻吩、双丁二酮化合物、二氧杂环己烯、烯醇醚、烯胺、9-亚烷基苍耳烷、9-亚烷基-n-9,10二氢化吖啶、芳基乙醚烯、芳基咪唑和光泽精以及它们的衍生物，更优选选自二甲基噻吩及其衍生物。

20、在本发明的另一些具体实施方式中，所述金属螯合物的金属是稀土金属或viii族金属，优选选自铕、铽、镝、钐、锇和钌，更优选选自铕。

21、在本发明的一些优选的实施方式中，所述金属螯合物包含选自下列的螯合剂：mtta、nha、bhht、bhhct、dpp、tta、nppta、nta、topo、tppo、bfta、2,2-二甲基-4-全氟丁酰-3-丁酮(fod)、2,2’-联吡啶(bpy)、联吡啶基羧酸、氮杂冠醚、氮杂穴状配体和三辛基氧化膦以及它们的衍生物。

22、在本发明的一些实施方式中，所述发光化合物是二甲基噻吩的衍生物，所述金属螯合物是铕螯合物。

23、在本发明的一些实施方式中，所述基质选自带、片、棒、管、孔、微滴定板、珠、粒子和微球；优选为珠和微球。

24、在本发明的另一些实施方式中，所述基质是磁性或非磁性粒子。

25、在本发明的一些实施方式中，所述不同粒径的受体微球的基质的材质相同或不同。

26、在本发明的一些具体实施方式中，所述基质材料选自天然的、合成或改性的天然存在的聚合物，其包括但不限于：琼脂糖、纤维素、硝化纤维素、醋酸纤维素、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、尼龙、聚丁酸乙烯或聚丙烯酸酯。

27、在本发明的一些优选的实施方式中，所述基质为醛基化乳胶微球；优选为醛基化聚苯乙烯乳胶微球。

28、在本发明的一些实施方式中，所述基质的表面直接连接有生物活性物质，所述生物活性物质能够与待测目标分子特异性结合。

29、在本发明的另一些实施方式中，所述基质的表面包被包覆层，所述包覆层的表面连接有生物活性物质，所述生物活性物质能够与待测目标分子特异性结合。

30、在本发明的一些实施方式中，所述包覆层中的包覆物选自多糖、高分子聚合物或生物大分子，优选为多糖。

31、在本发明的另一些实施方式中，所述基质的表面包被至少两个连续多糖层的涂层，其中第一多糖层与第二多糖层自发关联。

32、在本发明的一些实施方式中，所述连续多糖层中的每一层自发地与前一多糖层中的每一层相关联。

33、在本发明的另一些实施方式中，所述多糖具有侧基官能团，所述连续多糖层的所述官能团与所述前一多糖层的所述官能团所带电荷相反。

34、在本发明的一些实施方式中，所述多糖具有侧基官能团，并且所述多糖的所述连续层通过所述连续层的所述官能团与所述前一层的所述官能团之间的反应与所述前一多糖层共价连接。

35、在本发明的另一些实施方式中，所述连续多糖层的所述官能团在胺官能团和胺反应性官能团之间交替。

36、在本发明的一些实施方式中，所述胺反应性官能团是醛基或羧基。

37、在本发明的另一些实施方式中，所述第一多糖层自发地与所述载体相关联。

38、在本发明的一些实施方式中，所述涂层的最外一层多糖层具有至少一个侧基官能团。

39、在本发明的另一些实施方式中，所述涂层的最外一层多糖层的侧基官能团选自醛基、羧基、巯基、氨基、羟基和马来胺基中的至少一种；优选选自醛基和/或羧基。

40、在本发明的一些实施方式中，所述涂层的最外一层多糖层的侧基官能团直接地或间接地与生物活性物质连接。

41、在本发明的另一些实施方式中，所述多糖选自含有三个或更多个未修饰或修饰的单糖单元的碳水化合物；优选选自葡聚糖、淀粉、糖原、菊粉、果聚糖、甘露聚糖、琼脂糖、半乳聚糖、羧基葡聚糖和氨基葡聚糖；更优选选自葡聚糖、淀粉、糖原和聚核糖。

42、在本发明的一些实施方式中，所述不同粒径的受体微球的基质粒径相同。

43、在本发明的另一些实施方式中，所述不同粒径的受体微球的基质粒径不同。

44、在本发明的一些实施方式中，所述活性氧为单线态氧。

45、本发明第二方面提供了一种利用如本发明第一方面所述的方法来检测待测样品中待测目标分子是否存在和/或待测目标分子的浓度的化学发光分析仪。

46、在本发明的一些实施方式中，所述化学发光分析仪至少包括如下部分：

47、孵育模块，其用于为待测样本和至少两种不同粒径的受体微球混合后发生化学发光反应提供合适的温度环境；

48、检测模块，其用于检测受体微球与活性氧反应产生的化学发光信号；

49、处理器，其根据检测模块检测到的化学发光信号的情况判断待测样本中是否存在待测目标分子和/或待测目标分子在待测样本中的浓度。

50、本发明第三方面提供了一种如本发明第一方面所述的方法和/或如本发明第二方面所述的化学发光分析仪在检测包括ctni在内的心肌损伤标志物和/或包括降钙素原在内的炎症标志物中的应用。

51、本发明的有益效果为：本发明所述化学发光分析方法，通过在待测样本中加入包含至少两种不同粒径的受体微球(小粒径的受体微球和大粒径的受体微球)，由于小粒径的受体微球能拓宽检测量程、大粒径的受体微球能提高检测灵敏度，使得本发明所述方法的检测性能较现有技术得到大幅提升，既有超高的灵敏度，又有很宽的检测量程。另外，由于小粒径受体微球的反应速度快，因此采用本发明所述方法进行检测时还能缩短检测时间，反应速度得到提升。