一种阿加曲班原料或制剂中杂质的检测方法与流程

本发明涉及药物检测，具体涉及一种阿加曲班原料或制剂中杂质的检测方法。

背景技术：

1、阿加曲班为白色或类白色结晶性粉末，易溶于冰醋酸，略溶于甲醇，微溶于乙醇，极微溶于水。阿加曲班，其化学名为(2r,4r)-4-甲基-1-[n2-((r,s)-3-甲基-1,2,3,4-四氢-8-喹啉磺酰基)-l-精氨酰基]-2-哌啶羧酸一水合物，其化学成分是21(r)和21(s)的混合物，二者比例通常是64～65:36～35。其结构式为：

2、

3、阿加曲班(c23h36n6o5s·h2o，526.66)是一种人工合成的单价小分子直接凝血酶抑制剂，能够有选择地、可逆地与凝血酶催化位点结合，不但可以灭活液相凝血酶，还能够灭活与纤维蛋白血栓结合的凝血酶，临床上主要被用于肝素诱导的血小板减少及血栓症、经皮冠状动脉介入治疗、脑卒中溶栓血栓性疾病，目前临床使用剂型以注射剂为主，应用广泛。

4、阿加曲班注射液(argatroban injection)是由东京田边制药株式会社(现田边三菱制药株式会社)、第一制药株式会社(现第一三共株式会社)联合研制的抗血栓药。1990年该品种注射液(规格为20ml：10mg)在日本首次上市，用于治疗外周血栓病，1996年批准用于急性缺血性脑中风的治疗，2000年7月经美国fda批准上市(规格为2.5ml：250mg)，2002年在我国上市，2005年田边三菱制药株式会社开发了规格为10mg：2ml的注射液。

5、阿加曲班注射液，杂质(有关物质)的检测方法是其质量控制的关键。参考美国药典(usp43)阿加曲班原料药与阿加曲班注射液质量标准、日本药典(jp17)收载的阿加曲班原料药质量标准、阿加曲班注射液进口注册标准(jx20090312)并结合本品处方工艺和降解途径进行全面的杂质谱分析，其中立体异构体杂质的控制是阿加曲班注射液质量控制的难点之一，阿加曲班含有4个手性中心，有3个对应异构体杂质，分别为2s,4s-异构体、2s,4r-异构体和2r,4s-异构体，其中杂质2s,4s-异构体为工艺降解杂质，在进口注册标准中已有收载和研究，杂质2s,4r-异构体和2r,4s-异构体为工艺杂质，在现有标准中未进行收载和研究。

6、通过检测专利或文献，检索到：

7、中国专利cn104237397a中公开了一种阿加曲班注射液有关物质检测方法：色谱柱优选为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相优选为冰醋酸缓冲液和甲醇混合液，等度洗脱，但该方法仅能分离检测杂质f(日本if文件杂质a)和杂质g(日本if文件杂质b)两种杂质，对未报道的2s,4r-异构体和2r,4s-异构体杂质未进行定量分析检测，并且未涉及到各国药典及文献报道的其它杂质，检测杂质种类少。

8、浙江大学的硕士论文《阿加曲班原料药中的杂质控制》建立了一种阿加曲班原料药的检测方法，色谱柱优选为十八烷基硅烷键合硅胶，以冰醋酸缓冲液、甲醇、乙腈混合液为流动相，等度洗脱方式，该方法仅对杂质f(日本if文件杂质a)和杂质g(日本if文件杂质b)两种杂质进行有效控制，对未报道的2s,4r-异构体和2r,4s-异构体杂质未进行定量分析检测，并且未涉及各国药典及文献报道的其他杂质，检测杂质种类少。

9、现有专利或文献中并未涉及到立体异构杂质2s,4r-异构体、2r,4s-异构体的研究，且检测杂质种类少。针对现有技术的缺陷和不足，本发明提出一种阿加曲班注射液中杂质的检测方法，可分离和检测已报道的阿加曲班注射液中12种杂质，12种杂质分别为：未报道的2种杂质(2s,4r-异构体、2r,4s-异构体)和药典及文献报道的10种杂质(杂质2s,4s-异构体、杂质g、杂质5、杂质k、杂质l、杂质e、杂质o、杂质c、杂质i和杂质f)；与此同时，对阿加曲班注射液中3种杂质进行分离和定量分析检测，3种杂质分别为：未报道的2种杂质(2s,4r-异构体、2r,4s-异构体)和关键降解杂质g。本发明杂质检测方法，专属性好，分离效果良好，灵敏度高，定量准确，杂质检测种类显著增加。

技术实现思路

1、随着药品质量标准的提升，对药物检测的精准度提出了更高的要求。针对现有技术中存在的缺陷和不足，本发明申请提出一种阿加曲班原料或制剂中杂质的检测方法，可分离并检测阿加曲班原料或制剂中的12种杂质。具体如下：

2、首先，可分离和检测阿加曲班注射液中12种杂质，12种杂质分别为：未报道的2种杂质(2s,4r-异构体、2r,4s-异构体)和药典及文献报道的10种杂质(杂质2s,4s-异构体、杂质g、杂质5、杂质k、杂质l、杂质e、杂质o、杂质c、杂质i和杂质f)；

3、其中，可分离和定量分析检测阿加曲班注射液中3种杂质，3种杂质分别为：未报道的2种杂质(2s,4r-异构体、2r,4s-异构体)和关键降解杂质g。

4、所述方法①专属性好(可检测12种杂质，分离度大于1.28)，分离效果良好，②灵敏度高(各杂质的定量限低至0.5104μg/ml，相当于限度浓度的0.1％；检测限低至0.2092μg/ml，相当于限度浓度的0.04％)，③定量准确(准确度显著提高4倍以上)，④杂质检测种类显著增加(杂质检测种类由2种(杂质f和杂质g)显著增加至12种)。

5、阿加曲班注射液中的各杂质信息如下：

6、

7、

8、一种阿加曲班原料或制剂中杂质的检测方法，具体来说，包括如下技术方案：

9、采用高效液相色谱方法进行检测，色谱条件包括：

10、色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

11、流动相a为冰醋酸缓冲液和四氢呋喃的混合溶液，体积比为冰醋酸缓冲液：四氢呋喃＝(85～90):(15～10)，冰醋酸缓冲液的ph为5.8～6.2；

12、流动相b为甲醇和乙腈的混合液，体积比为甲醇:乙腈＝(58～62:(42～38)，优选的，体积比为甲醇:乙腈＝(60:40)；

13、洗脱方式：梯度洗脱。

14、在一些优选的实施方案中，其中，所述色谱柱为ymc j’sphere ods-h18，4.6mm×250mm，4.0μm或gl sciences ods-3，4.6mm×250mm，3μm。

15、在一些优选的实施方案中，其中，所述流动相a所述流动相a中冰醋酸缓冲液和四氢呋喃的混合溶液的体积比为：冰醋酸缓冲液:四氢呋喃＝86.5:13.5。

16、在一些优选的实施方案中，其中，所述流动相a中冰醋酸缓冲液的ph为6.0。

17、在一些优选的实施方案中，其中，所述梯度洗脱的程序为：

18、 时间/min 流动相a/％ 流动相b/％ 0～90 95 5 90～100 95～40 5～60 100～110 40 60 110～111 40～95 60～5 111～130 95 5

19、。

20、在一些实施方案中，其中，所述色谱条件的检测波长为257～261nm，优选为259nm。

21、在一些实施方案中，其中，所述色谱柱的流速为0.7～0.9ml/min，优选为0.8ml/min。

22、在一些实施方案中，其中，所述色谱柱的柱温为38～42℃，优选为40℃。

23、在一些实施方案中，其中，所述阿加曲班冰醋酸缓冲液和四氢呋喃的混合溶液的中杂质包括以下一种或多种：

24、

25、

26、

27、在一些实施方案中，其中，所述阿加曲班原料或制剂中杂质包括杂质2s,4r-异构体、杂质2r,4s-异构体和杂质g。

28、在一些实施方案中，其中，所述阿加曲班原料或制剂中杂质包括2r,4s-异构体和杂质g。

29、在一些实施方案中，其中，所述阿加曲班原料或制剂中杂质包括2s,4r-异构体、2r,4s-异构体、杂质2s,4s-异构体、杂质g、杂质5、杂质k、杂质l、杂质e、杂质o、杂质c、杂质i和杂质f。

30、在一些实施方案中，其中，所述制剂为注射液。

31、本发明所取得的有益效果：

32、本技术提供了一种阿加曲班原料或制剂中杂质的检测方法，相对于现有其它标准或技术中的检测方法，本发明杂质检测方法的优势在于：

33、1)采用本发明杂质分析方法，可检测阿加曲班原料或制剂中12种杂质：

34、未报道的2种杂质：2s,4r-异构体、2r,4s-异构体；

35、药典及文献报道的10种已知杂质：杂质2s,4s-异构体、杂质g、杂质5、杂质k、杂质l、杂质e、杂质o、杂质c、杂质i和杂质f；

36、2)采用本发明杂质分析方法，可分离和定量分析检测阿加曲班原料或制剂中3种杂质：

37、未报道的2种杂质：2s,4r-异构体、2r,4s-异构体；

38、关键的降解杂质：杂质g。本发明的一种阿加曲班注射液中杂质检测方法，①专属性好(可检测12种杂质，分离度大于1.28)，分离效果良好，②灵敏度高(各杂质的定量限低至0.5104μg/ml，相当于限度浓度的0.1％；检测限低至0.2092μg/ml，相当于限度浓度的0.04％)，③定量准确(准确度显著提高4倍以上)，④杂质检测种类显著增加(杂质检测种类由2种显著增加至12种)。