ANXA1作为标志物筛选肿瘤治疗方案的应用

本发明涉及肿瘤治疗，具体涉及anxa1作为标志物或靶基因在筛选肿瘤治疗方案、改善个体对tlr3激动剂免疫治疗的耐受性、以及在单独或联合tlr3激动剂治疗肿瘤中的应用。

背景技术：

1、anxa1(annexin1，膜联蛋白1)是一个高效的内源免疫调节蛋白，在许多癌症中发挥重要作用，参与细胞增殖、凋亡、转移和侵袭。anxa1不仅存在于细胞核与细胞质中，同时也能分泌到细胞外参与其他细胞调控。现有技术证实其可以作为甲状腺癌、子宫内膜癌的预后标志物，但是不能作为尿路上皮癌的预后标志物。

2、脑胶质瘤是由于大脑和脊髓胶质细胞癌变所产生的、最常见的原发性颅脑肿瘤。如同其他肿瘤(疾病)一样，胶质瘤也是由于先天的遗传高危因素和环境的致癌因素相互作用所导致的。一些已知的遗传疾病，例如神经纤维瘤病(i型)以及结核性硬化疾病等，为脑胶质瘤的遗传易感因素。目前，对于脑胶质瘤的治疗多采用调节血脑屏障来抑制胶质瘤生长，例如专利文献cn107385029a等。本研究团队采用瘤内给药方式对脑胶质瘤术后复发患者进行tlr3激动剂治疗，这一方式既能绕过血脑屏障，相对封闭的环境也给肿瘤抗原暴露并与免疫细胞充分接触提供了有利空间。但是前期临床数据显示，有大约30％的患者经治疗后出现病情好转、肿瘤缩小或进展稳定，无疾病进展生存期和总生存期均得到显著延长。然而，仍有近七成患者对tlr3激动剂治疗呈现不应答状态，因此，本技术进一步探究患者应答差异背后的分子机制。找到了一个免疫治疗预后的基因标志物-anxa1，不仅有利于尽早优化患者的免疫治疗方案，而且有望为新药靶点开发提供理论依据和实验基础，进而实现逆转这些不应答患者的免疫耐受，进一步扩大tlr3激动剂用于gbm治疗的获益人群。

3、对此，非专利文献：comparative analysis of annexin-1in neuroepithelialtumors shows altered expression with the grade of malignancy but is notassociated with survival(schittenhelm j，mod pathol 2009，doi 10.1038/modpathol.2009.132)中公开了利用微阵列对394个不同等级的神经胶质肿瘤和81个正常大脑样本的anxa1进行了免疫化学研究。并结合蛋白印迹实验和定量pcr对结果进行了验证，结果显示anxa1的表达水平与患者生存期不相关。

4、但是，上述现有技术并没有公开将anxa1与tlr3激动剂的治疗联系起来。

技术实现思路

1、本技术创造性的发现anxa1与tlr3激动剂的免疫治疗密切相关，通过调控anxa1的表达有效改善tlr3激动剂的免疫治疗肿瘤的应答，可以有效用于筛选肿瘤治疗的方案，通过干扰肿瘤本身anxa1的表达或拮抗肿瘤anxa1受体fpr1来阻断通路下游信号，可以改善个体对tlr3激动剂治疗的耐受性。优先筛选出适合tlr3激动剂的患者进行治疗，也提示通过抑制肿瘤anxa1的表达与tlr3激动剂协同治疗肿瘤，可能获得更加优异的治疗效果。

2、本发明的第一方面，提供了一种anxa1作为标志物在筛选肿瘤治疗方案或制备筛选肿瘤治疗方案的产品中的应用。

3、优选的，所述的治疗方案包括是否适用tlr3激动剂。

4、优选的，所述的筛选肿瘤治疗方案包括检测anxa1的表达。

5、本发明的第二方面，提供了一种anxa1或检测anxa1的试剂在筛选肿瘤治疗方案的产品中的应用。

6、优选的，所述的治疗方案包括是否适用tlr3激动剂。

7、优选的，所述的筛选肿瘤治疗方案包括检测anxa1的表达。

8、本发明的第三方面，提供了anxa1作为标志物在制备诊断和/或预后评估肿瘤的产品中的应用。

9、优选的，所述的诊断和/或预后评估肿瘤包括检测anxa1的表达。

10、优选的，所述的诊断和/或预后评估肿瘤包括通过anxa1的表达水平确定是否患有肿瘤、治疗后再次患有肿瘤的可能性、首次患者或治疗后再次患有肿瘤的患者是否适合tlr3激动剂治疗以及未患有肿瘤或肿瘤经治疗后未复发时评估若患有肿瘤是否适合tlr3激动剂治疗。

11、本发明的第四方面，提供了anxa1或检测anxa1的试剂在制备诊断和/或预后评估肿瘤的产品中的应用。

12、优选的，所述的检测anxa1的试剂为检测anxa1表达的试剂。

13、本发明的第五方面，提供了anxa1作为靶基因在制备治疗肿瘤的产品中的应用。

14、优选的，所述的治疗肿瘤为单独或联合tlr3激动剂进行治疗。进一步优选的，所述的治疗肿瘤为采用anxa1受体fpr1的拮抗剂单独或联合tlr3激动剂进行治疗。

15、优选的，所述的治疗包括抑制anxa1的表达。

16、优选的，所述的tlr3激动剂的加入量为0.25-0.5mg/次，5次注射。

17、优选的，所述的治疗包括改善个体对tlr3激动剂治疗的耐受性。

18、在本发明的一个具体实施方式中，所述的改善为由不应答变为应答或者由低应答变为高应答。

19、本发明的第六方面，提供了anxa1或抑制anxa1的试剂在制备治疗肿瘤的产品中的应用。

20、优选的，所述的抑制anxa1的试剂为抑制anxa1表达的试剂。

21、优选的，所述的治疗肿瘤为单独或联合tlr3激动剂进行治疗。

22、优选的，所述的tlr3激动剂的加入量为0.25-0.5mg/次，5次注射。

23、优选的，所述的治疗包括抑制anxa1的表达。

24、优选的，所述的治疗包括改善个体对tlr3激动剂治疗的耐受性。

25、在本发明的一个具体实施方式中，所述的改善为由不应答变为应答或者由低应答变为高应答。

26、本发明的第七方面，提供了一种确定个体是否适合tlr3激动剂治疗的方法，所述的方法包括检测anxa1的表达。

27、如果anxa1的表达水平明显高，则不适合tlr3激动剂治疗。

28、如果anxa1的表达水平明显低，则适合tlr3激动剂治疗。

29、本发明的第八方面，提供了一种肿瘤治疗方案的筛选方法，所述的筛选方法包括检测anxa1的表达。优选的，anxa1低表达型的个体适用tlr3激动剂的治疗。所述的anxa1低表达型：免疫组织化学染色肿瘤细胞，anxa1染色阳性肿瘤细胞数低于<30％的患者anxa1表达水平被定义为anxa1低表达型。

30、本发明的第九方面，提供了一种改善个体对tlr3激动剂治疗的耐受性的方法，所述的方法包括抑制anxa1的表达。

31、本发明的第十方面，提供了anxa1作为标志物在治疗肿瘤中的应用，所述的应用包括检测anxa1的表达量，然后将肿瘤分为anxa1高表达型和anxa1低表达型，对anxa1低表达型的个体单独或联合tlr3激动剂进行治疗。

32、优选的，所述的应用包括对anxa1高表达型的个体施加抑制anxa1的试剂，以及单独或联合tlr3激动剂进行治疗。

33、进一步优选的，所述的应用包括向个体施加抑制anxa1的试剂和tlr3激动剂。

34、优选的，所述的tlr3激动剂的加入量为0.25-0.5mg/次，5次注射。

35、其中，免疫组织化学染色肿瘤细胞，anxa1染色阳性肿瘤细胞数≥30％的患者anxa1表达水平被定义为anxa1高表达型，anxa1染色阳性肿瘤细胞数低于<30％的患者anxa1表达水平被定义为anxa1低表达型。

36、所述的肿瘤选自淋巴瘤、非小细胞肺癌、宫颈癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、脑胶质瘤、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。

37、本发明的第十一方面，提供了一种anxa1基因敲除或敲低的细胞的构建方法，所述的构建方法包括使用sgrna进行细胞的构建。

38、优选的，所述的sgrna的靶位点序列如seq id no：4、5和/或6所示。

39、本发明的第十二方面，提供了一种sgrna，所述的sgrna的靶位点序列如seq idno：4、5和/或6所示。

40、本发明的第十三方面，提供了一种上述的构建方法获得的细胞。

41、本发明的第十四方面，提供了一种动物模型的构建方法，所述的构建方法包括将上述anxa1基因敲除或敲低的细胞或anxa1过表达的细胞导入非人动物。

42、优选的，所述的非人动物包括但不限于啮齿类动物(例如大鼠或小鼠)、猪、猴、牛、羊、兔或狗等等可以作为动物模型的非人动物。

43、本发明的第十五方面，提供了一种上述的sgrna、上述的细胞、上述的构建方法获得的动物模型在筛选治疗脑胶质瘤的药物或方案中的应用。

44、本发明的第十六方面，提供了一种上述的sgrna、上述的细胞、上述的构建方法获得的动物模型在制备治疗、诊断或预后评估脑胶质瘤的药物或方案中的应用。

45、本发明的第十七方面，提供了一种anxa1作为标志物在检测肿瘤分型或制备检测肿瘤分型的产品中的应用。

46、优选的，所述的肿瘤分型为anxa1高表达型和anxa1低表达型。

47、本发明的第十八方面，提供了一种肿瘤分型的方法，所述的方法包括检测anxa1的表达量，然后将肿瘤分为anxa1高表达型和anxa1低表达型。

48、本发明所述的方法主题和应用主题可以为治疗目的或非治疗目的。

49、本发明所述的“tlr3激动剂”包括但不限于poly(i:c)及其他tlr3激动剂。

50、本发明所述的“产品”包括检测anxa1的试剂和/或抑制anxa1的试剂。优选包括但不限于检测anxa1的试剂、抑制anxa1的试剂、药物、试剂盒、设备等等。其中，所述的检测anxa1的试剂根据检测方法的不同包含着不同的内容，例如可以采用pcr、测序或wb等等的方法检测，相应的，检测anxa1的试剂至少包含pcr所需试剂、测序所需试剂或者wb所需试剂等等。优选包括但不限于引物、探针、蛋白结合配体、染色剂等等。所述的抑制anxa1的试剂根据抑制原理不同包含着不同的内容，例如抗原抗体结合、敲除、敲低等等，相应的，抑制anxa1的试剂至少包含相应的抗体、敲除所需试剂、敲低所需试剂等等，优选包括但不限于自小分子、anxa1特异性sirna、anxa1特异性mirna、编码anxa1特异性sirna的dna、编码anxa1特异性mirna的dna以及抗膜联蛋白a1抗体、微抗体、fab或片段、骆驼抗体或纳米抗体等等。

51、本发明术语“包括”或“包含”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。

52、本发明所述的“个体”可以为人或非人动物，所述的非人动物可以为鼠、牛、羊、兔、猪、猴等非人哺乳动物。

53、本发明所述的“治疗”表示在疾病已开始发展后减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。

54、本发明所述的“诊断”是指以查明患者过去、诊断时或将来是否患有疾病或病症，或者是查明疾病的进展或将来可能的进展。

55、本发明所述的“预后评估”指评估患者对治疗的反应，及将来患病的风险度。

56、本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、非小细胞肺癌、宫颈癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、脑胶质瘤、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括b细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区b细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。优选的，所述的肿瘤为脑胶质瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的脑胶质瘤选自胶质母细胞瘤、星型细胞瘤、少枝细胞瘤或室管膜瘤中的任一种或其混合型(例如少枝--星形细胞瘤等等)；或者，所述的脑胶质瘤选自幕上胶质瘤、幕下胶质瘤或桥脑胶质瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的脑胶质瘤选自多形性胶质母细胞瘤、间变型星形细胞瘤或弥漫性中线胶质瘤。

57、本技术简写与全称对照：

58、anxa1：annexin1，膜联蛋白1。

59、tlr3：toll-like receptor 3，toll-样受体3

60、poly(i:c)：polyinosinic:polycytidylic acid，聚肌胞苷酸。

61、he：hematoxylin-eosin，苏木精和伊红染色。

62、dab：diaminobenzidine，二氨基联苯胺。

63、u87：人脑星形胶质母细胞瘤细胞。

64、u251：人神经胶质细胞瘤细胞。

65、pei：聚乙烯亚胺。

66、gbm：多形性胶质母细胞瘤。