本发明涉及基于cu2s/cdsse异质结构的神经元特异性烯醇化酶电致化学发光传感器的制备方法。具体是采用异质结构cu2s/cdsse作为电致化学发光体，用au-in2o3作为标记物标记检测抗体，制备了一种检测神经元特异性烯醇化酶的猝灭型电致化学发光传感器，属于新型功能材料与生物传感检测。
背景技术：
1、小细胞癌具有易转移、增殖快、恶性程度高、预后差、早期无明显临床症状等特点。大多数sclc患者确诊时已经发展到中晚期，即使治疗，患者生存率也较低。因此，早期诊断小细胞肺癌意义重大。作为肿瘤标志物，神经元特异性烯醇化酶是一种位于神经内分泌细胞的脑蛋白，具有较高的特异性和敏感性，其含量可作为区分正常人和患者的标准。尽管已经开发了许多用于检测nse的分析方法，但是这些方法中的大多数需要复杂的程序、昂贵的仪器和高消耗。因此，开发一种更方便、更准确的检测nse 的新方法具有重要意义。
2、电致化学发光(ecl)是一种将电能转化为光能的多功能分析技术。在电极表面上产生的物质的激发态通过电子转移形成，这是电极上的特殊化学发光现象，是电化学和光谱学的理想结合体，以其独特的功能成为研究的热点方向。近年来，三元合金半导体在各个领域引起了广泛关注。其中，cdsse作为重要的ii–vi三元半导体之一，其带隙在2.44 ev至1.74 ev之间，在传感器、光电子器件、太阳能电池、光伏系统等方面具有潜在的应用前景。由于高表面能和小尺寸，cdsse不稳定且易于聚集，这对于导电材料来说是非常理想的。本发明通过蒸干法合成了具有异质结构的二维纳米复合材料cu2s/cdsse应用于电致化学发光传感器。
技术实现思路
1、本发明的目的之一是采用一锅法合成了三元合金半导体cdsse，并采用蒸干法与雪花状cu2s纳米材料形成异质结构作为电致化学发光材料，该材料表现出优异的电致化学发光性能。
2、本发明的目的之二是用au-in2o3作为标记物标记神经元特异性烯醇化酶检测抗体，au-in2o3紫外可见光谱与cu2s/cdsse电致化学发光发射光谱重叠，会极大降低cu2s/cdsse的电致化学发光信号，使传感器的灵敏度大大提高。
3、本发明的目的之三以cu2s/cdsse作为基地材料，以au-in2o3作为作为检测抗标记物，制备一种灵敏度高、稳定性好、检测速度快的电致化学发光传感器，实现了对神经元特异性烯醇化酶灵敏检测的目的。
4、本发明的目的四是构建了一种信号猝灭型的免疫传感器，传感器拥有较低的检测限和更高的灵敏度，可以扩展到其他癌症标记物的检测。
5、本发明的技术方案如下：
6、1、一种基于cu2s/cdsse异质结构的神经元特异性烯醇化酶电致化学发光传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
7、（1）雪花状硫化亚铜cu2s的制备
8、0.341~0.682 g的二水合氯化亚铜cucl2·2h2o和0.228~0.456 g硫脲ch4n2s超声溶解在60 ml乙二胺c2h8n2中，形成均匀溶液，随后，将上述混合溶液转移到带有聚四氟乙烯衬里的100 ml高压釜中，并在80℃下保持8 h，反应后获得的产物分别用乙醇和水清洗三次，最后，将沉淀物置于60℃的真空烘箱中干燥8 h，充分研磨后获得cu2s；
9、（2）硒硫化镉cdsse纳米颗粒的制备
10、2.66~5.32 g乙酸镉cd(ch3co2)2、0.19~0.38 g硫脲ch4n2s和1.29~2.58 g亚硒酸钠na2seo3分别分散在10 ml蒸馏水中。随后，将10 ml水合肼加入上述混合溶液中，并转移到带有聚四氟乙烯衬里的100 ml高压釜中，在180℃下保持8 h，最后，通过在水中和乙醇中离心洗涤收集产物，并在60℃下干燥过夜。将粉末研磨后，即得到cdsse纳米颗粒；
11、（3）异质结构cu2s/cdsse的制备
12、将质量比为1:100的100 mg cu2s和cdsse加入到50 ml乙醇中，超声处理以形成均匀的悬浮液。然后，在80℃的恒温水浴中加热并蒸发多余的乙醇。将得到的粉末进行研磨，即得到异质结构cu2s/cdsse；
13、（4）金掺杂氧化铟au-in2o3纳米颗粒的制备
14、0.2~0.4 g 泊洛沙姆pluronic f-127溶解在46 ml水中，随后滴加8 ml乙醇，超声分散为透明溶液后，滴加0.5~1.0 ml氨水，持续搅1 h后，再将0.2~0.4 g单宁酸和0.38~0.76 ml甲醛加入到上述溶液中，持续剧烈搅拌24 h后，取0.03~0.06 g四水合氯化铟incl3·4h2o和0.147~0.294 ml质量分数为2 %的氯金酸haucl4溶液加入，再次搅拌24 h，随后将溶液转移到带有聚四氟乙烯衬里的100 ml高压釜中，在100℃下保持24 h，最后通过乙醇和水清洗所得固体，在60℃下真空干燥过夜后，将粉末固体均匀铺在坩埚中，在空气氛围下温度为400℃保持2 h，即得到au-in2o3纳米颗粒；
15、（5）抗体孵育的au-in2o3的制备
16、10~20 mg au-in2o3超声分在10 ml磷酸缓冲溶液pbs中，取取1~2 ml浓度为1 µg/ml神经元特异性烯醇化酶nse检测抗体ab2加入上述溶液中，并在4℃下振荡8 h，加入500~1000 µl质量分数为百分之一的牛血清白蛋白bsa溶液，继续在4℃孵育6 h占据非特异性位点；即得到抗体孵育au-in2o3的材料；
17、（6）电致化学发光传感器的制备
18、1）将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0 µm、0.3 µm、0.05 µm氧化铝抛光粉抛光处理，用超纯水冲洗干净；
19、2）将3~6 mg/ml的cu2s/cdsse分散液超声至所有颗粒均匀分散为悬浮液，在玻碳电极表面滴加10 µl上述悬浮液作为传感基地，将其置于37℃晾干；
20、3）滴加6 µl、浓度为1 mg/ml 的n-羟基琥珀酰亚胺（edc），1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐（nhs），将其置于37℃晾干；
21、4）滴加6 µl、浓度为10 µg/ml的nse抗体溶液，用ph 7.4的磷酸盐缓冲溶液pbs冲洗电极表面，将其置于4℃晾干；
22、5）滴加3 µl、质量分数为1~3%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用ph 7.4的磷酸盐缓冲溶液pbs冲洗电极表面，将其置于4℃晾干；
23、6）滴加6 µl、一定浓度的 nse标准溶液，37 ℃下孵化0.5 ~ 2 h，用ph 7.4的磷酸盐缓冲溶液pbs冲洗电极表面，将其置于4℃晾干；
24、7）滴加5 µl、浓度为1 mg/ml的抗体孵育au-in2o3溶液，用ph 7.4的磷酸盐缓冲溶液pbs冲洗电极表面，将其置于4℃晾干，传感器构建完毕。
25、2、如权利要求1所述制备方法制备得到的电致化学发光传感器的检测方法，其特征在于，步骤如下：
26、（1）使用电化学分析仪三电极体系进行测试，饱和银/氯化银电极为参比电极，铂电极为辅助电极，制备的玻碳电极的传感器为工作电极，在10 ml、ph 6.0 ~ 8.5的pbs，50mm~180 mm的过硫酸钾溶液中进行测试；
27、（2）用循环伏安法对神经元特异性烯醇化酶进行检测，设置电压范围为-1.2~0 v
28、光电倍增管电压为700 v；
29、（3）电极装置完毕后，启动仪器，检测不同浓度nse对应的电致化学发光信号强度，绘制工作曲线；
30、（4）将待测的神经元特异性烯醇化酶抗原样品溶液代替神经元特异性烯醇化酶抗原标准溶液进行检测。
31、本发明的有益成果
32、（1）本发明成功合成了一种三元合金半导体cdsse纳米颗粒，并将其成功与雪花状cu2s结合，制备出一种异质结构，首次将其应用于电致化学发光传感器中，雪花状cu2s的存在，不仅提高cdsse导电性，同时可以催化s2o82-生成更多的so4•−,是得cdsse得电致化学发光信号进一步提高。解决了由于高表面能和小尺寸，cdsse不稳定且易于聚集得问题。
33、（2）本发明使用自模板法合成了一种介孔au-in2o3纳米球，与传统的检测抗体标记物相比，不需要在表面额外负载au纳米颗粒用于连接检测抗体。
34、（3）本发明制备的光电化学传感器，用于神经元特异性烯醇化酶的检测，响应时间短，线性范围宽，检测限低，稳定性和重现性好，可实现简单、快捷、高灵敏和特异性的检测。本发明对神经元特异性烯醇化酶的检测线性范围为0.5 pg/ml ~ 100 ng/ml，检测限达16fg/ml。