一种基于分子印迹技术的IL-6生物传感器及制备方法

本发明涉及了一种il-6生物传感器，具体涉及一种基于分子印迹技术的il-6生物传感器及制备方法。

背景技术：

1、目前，生物大分子传感器正飞速发展，现有的生物大分子传感器通常采用生物抗体将目标分子结合。例如，公开号为cn115819594a的中国发明专利，公开了一种“抗pd1纳米抗体”，其通过向大肠杆菌转化含有纳米抗体基因序列的质粒，使用大肠杆菌表达生物抗体。然而通过生物抗体进行分子识别的生物传感器方法存在缺陷。

2、其一，由于生物抗体成本较高，制备过程繁琐，结合能力不完全，因而采用常规方法制造生物大分子传感器成本较高，在市场上竞争力较差。其二，生物大分子传感器通常还要求检测速度快，现有的酶联免疫吸附剂测定方法由于其结合时间较长，最长可达到一两天甚至更久，才得以精确测定生物大分子含量，无法达到快速检测的目的，并最终影响测定效率。

3、另外，以生物抗体为识别元件的生物传感器有保存时间不长、保存条件苛刻的致命问题，敏感脆弱的生物抗体不能长时间地以常温、空气暴露的形式存在，要求使用者存储在冰箱、商家冷链运输、必须在一年内使用等诸多限制都使隐形成本进一步升高。

4、当前，由于市场上缺乏快速检测炎症的便携式家用设备，且大型血检设备造价昂贵、操作复杂，故目前亟需研发用于自检的生物传感器。

技术实现思路

1、为了解决背景技术中存在的问题，本发明所提供一种基于分子印迹技术的白细胞介素-6生物传感器及制备方法。

2、本发明采用的技术方案是：

3、一、一种基于分子印迹技术的il-6生物传感器：

4、il-6生物传感器包括其上具有对电极、工作电极、参比电极和聚合物修饰层的丝网印刷石墨电极，对电极、工作电极、参比电极和聚合物修饰层位于丝网印刷石墨电极的同一侧面，对电极、工作电极和参比电极位于丝网印刷石墨电极的一侧，聚合物修饰层位于丝网印刷石墨电极的另一侧，对电极、工作电极和参比电极的一端均连接至聚合物修饰层；对电极、工作电极和参比电极电连接外部电化学工作站。

5、所述的对电极、工作电极和参比电极均沿丝网印刷石墨电极的长度方向并相间隔布置，对电极和工作电极的一端连接至聚合物修饰层的边缘，参比电极的一端延伸至聚合物修饰层表面内，对电极、工作电极和参比电极的另一端均位于丝网印刷石墨电极的边缘。

6、所述的对电极和工作电极均为石墨烯电极，参比电极为金电极或银电极。

7、二、一种il-6生物传感器的制备方法：

8、方法包括如下步骤：

9、步骤1)预处理：丝网印刷石墨电极的聚合物修饰层所在的区域为电极圆盘区，使用氯化钾kcl溶液通过枪头滴加在电极圆盘区，使得氯化钾kcl溶液覆盖对电极和工作电极，然后使用计时安培法对丝网印刷石墨电极进行处理后完成预处理。

10、步骤2)形成印迹层：将白细胞介素-6il-6、吡啶和吡啶-2-甲酸三种溶液在常温下混合均匀并静置，然后滴于预处理过后的电极圆盘区表面进行孵育，使用循环伏安法cv处理并进行聚合后在电极圆盘区处形成印迹位点，最终形成印迹层；通过蛋白质与带电单体吡啶-2-甲酸的氢键相互作用形成印迹位点。

11、步骤3)印迹脱模：使用去离子水冲洗干净印迹层，向印迹层通过枪头滴加草酸二水合物进行孵育，然后使用去离子水冲洗干净印迹层，向印迹层通过枪头滴加磷酸缓冲液pbs进行孵育，然后使用去离子水冲洗干净印迹层，将印迹层浸入磷酸缓冲液中并使用循环伏安法进行处理后完成印迹脱模，最终形成聚合物修饰层，制备获得il-6生物传感器。

12、对修饰完成的丝网印刷石墨电极进行循环伏安法电化学表征，电化学测试在5.0mm亚铁氰化钾和铁氰化钾1:1浓度与0.1m氯化钾的测试液中进行，电位范围为-0.4v到0.7v，扫描速率为50mv/s。

13、所述的步骤1)中，具体为使用100μl～300μl的0.1m/ml的氯化钾kcl溶液通过枪头滴加在电极圆盘区，然后使用计时安培法，在1.7v下对电极圆盘区处理200秒后完成预处理；氯化钾kcl溶液不接触参比电极。

14、所述的步骤2)中，具体为将5～20μl的2～20μg/ml的白细胞介素-6il-6、30～60μl的0.01m/ml的吡啶和30～60μl的10～20μg/ml的吡啶-2-甲酸三种溶液在常温下混合均匀并静置30min获得混合溶液，然后取70μl的混合溶液滴于预处理过后的电极圆盘区表面进行孵育5min，混合溶液不接触参比电极，使用循环伏安法cv在-0.8到0.8v持续10个循环处理并聚合后在电极圆盘区处形成印迹位点，扫描速率为50mv/s。

15、所述的步骤3)中，具体为使用去离子水冲洗干净印迹层，向印迹层滴加100μl～300μl的0.05m的草酸二水合物并孵育3h，然后使用去离子水冲洗干净印迹层，向印迹层滴加100μl～300μl的ph 7.4的磷酸缓冲液pbs并孵育30min，然后使用去离子水冲洗干净印迹层，将印迹层浸入ph 6.0的磷酸缓冲液pbs中，使用循环伏安法在50mv/s的扫描速率下，在-0.3v到0.3v的循环伏安法条件下对印迹层进行10次循环处理后完成印迹脱模，最终形成聚合物修饰层，获得il-6生物传感器；草酸二水合物和磷酸缓冲液pbs均不接触参比电极。

16、三、一种il-6生物传感器的白细胞介素-6il-6检测方法：

17、方法包括如下步骤：

18、步骤1)将il-6生物传感器的具有对电极、工作电极和参比电极的一端插入电化学工作站兼容接口，电化学工作站兼容接口通过铜导线和电化学工作站连接，电化学工作站通过usb数据线和电脑连接。

19、步骤2)使用磷酸缓冲液pbs制备在pg/ml和μg/ml之间按预设梯度配置若干种浓度的白细胞介素-6il-6标准溶液，在常温下将各种浓度的白细胞介素-6il-6标准溶液分别滴加在聚合物修饰层上进行孵育，然后使用磷酸缓冲液pbs冲洗干净，在聚合物修饰层上滴加亚铁氰化钾和铁氰化钾的混合溶液。

20、步骤3)使用电化学阻抗法，在开路电位ocp中对聚合物修饰层上的白细胞介素-6il-6使用电化学工作站进行检测，获得若干阻抗结果，并通过电脑将各个阻抗结果进行拟合获得il6浓度-电荷转移电阻rct标准曲线；对每个阻抗结果拟合成图像，计算电荷转移电阻，绘制出数个点，拟合为标准曲线。

21、步骤4)将待检测的含有白细胞介素-6il-6的缓冲液滴加在聚合物修饰层上，在电化学工作站中使用il6浓度-电荷转移电阻rct标准曲线进行对比获得待检测浓度的白细胞介素-6il-6溶液的浓度并通过电脑进行显示，实现白细胞介素-6il-6的检测。

22、所述的步骤2)中，具体为使用ph 6.0的磷酸缓冲液pbs制备白细胞介素-6il-6标准溶液，然后在常温下将各种浓度的白细胞介素-6il-6标准溶液分别滴加在聚合物修饰层上进行孵育30min，然后在聚合物修饰层上滴加100μl～300μl的亚铁氰化钾和铁氰化钾浓度比例为1：1的混合溶液。

23、所述的步骤3)中，使用电化学阻抗法时，开路电位ocp的正弦电位扰动振幅为0.1v，频率范围为0.1至100khz。

24、本发明的有益效果是：

25、本发明白细胞介素-6生物大分子传感器采用分子印迹技术，替代了生物抗体技术，对目标分子进行捕获与结合，有效地避免了传统生物大分子传感器生物抗体制备工艺复杂，制备成本昂贵、保存条件严苛的缺点。同时，聚合物孔洞对生物大分子的特异性捕获功能，相较于传统生物抗体，无实效性变化，使目标生物分子检测精度得到保证。本生物传感器采用分子印迹层进行生物大分子的识别，快速、简便、便宜地对炎症因子白细胞介素-6浓度进行检测，突破了传统生物抗体检测生物大分子的局限性。