一种生物传感器及其在维生素C检测方面的应用的制作方法

本发明属于生物传感器，具体涉及一种生物传感器及其在维生素c检测方面的应用。

背景技术：

1、维生素c，又称维他命c、l-抗坏血酸，是一种多羟基化合物。维生素c在生物体内的浓度处于一定的范围，过低或过高均会导致某些疾病的产生，为此，准确的测试人体内、食品、药品等维生素c的含量具有重要意义。目前，维生素c的测试方法较多，包括比色法、紫外分光光度法、高效液相色谱法、电化学方法等，除电化学方法外，其他测试方法均操作复杂、需借助昂贵的仪器、检测耗时长、样品需要复杂的前处理等等问题。

2、电化学方法中的生物传感器是一类特殊的化学传感器，它是以生物活性单元(如，酶、抗体、核酸等)作为生物敏感基元，对被测目标物具有高度选择性的检测器，其中，以酶生物传感器的研究最为广泛。酶生物传感器是利用生化反应所产生的或消耗的物质的量，通过电化学装置转换成电信号，进而选择性地测测定出某种成分的器件。

3、酶生物传感器的发展经历了三个阶段：

4、(1)利用氧为中继体的电催化，它是通过测量反应物o2的减少或反应产物h2o2的产生量来实现；

5、(2)利用电子传递介体，它既不涉及o2，也不涉及h2o2，而是利用具有较低氧化电位的传递介体在电极上产生的氧化电流，对特定成分进行测定，从而避免了其他电活性物质的干扰，提高了测定的灵敏度和准确性；

6、(3)选择合适的接合剂，将酶共价键合到化学修饰电极上，或将酶固定到多孔电聚合物修饰电极上，使酶氧化还原活性中心与电极接近，酶与电极之间直接进行电子传递。

7、中国专利cn104316582a公开了工作电极生物反应物及其应用、电极式测试条，该发明利用粘结剂将抗坏血酸氧化酶、过氧化物酶和还原性电子媒介体固定在工作电极表面，利用抗坏血酸氧化酶催化反应产生的h2o2与还原性电子媒介体发生氧化还原反应产生的氧化性电子媒介体，再通过负电位测量氧化性电子媒介体的还原电流，该方法属于利用第一阶段和第三阶段的酶生物传感器进行改进，仍然需要构建复杂的电子媒介，同时，该发明的检测方法较为复杂，并且该发明旨在应用于全血中抗坏血酸含量的检测，应用场景限定较窄。

技术实现思路

1、为了解决现有的生物传感器存在构建复杂的问题，同时，利用该生物传感器检测维生素c时存在的检测方法复杂的问题，本发明提供一种生物传感器及其在维生素c检测方面的应用。

2、本发明的目的是提供一种生物传感器。

3、本发明的另一个目的是提供上述生物传感器在维生素c检测方面的应用。

4、本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

5、一种生物传感器，包括电极系统和信号处理系统，所述电极系统包括参比电极、对电极和工作电极，所述工作电极包括预处理电极和酶修饰电极，所述酶修饰电极的制备过程如下；

6、取1μl-2μl的抗坏血酸氧化酶溶液滴加在预处理电极的表面，干燥后得到酶修饰电极。

7、本发明采用双工作电极，首先，对双工作电极均作预处理，排除预处理过程对工作电极干扰，实现控制变量。然后，酶修饰处理过程中，利用酶的专一性，最终制备的预处理电极和酶修饰电极与参比电极、对电极组成电极系统，电极系统与信号处理系统(电化学工作站)进行组装，最终制备得到生物传感器。

8、进一步地，所述预处理电极的制备过程如下：

9、取1μl-3μl的抗蛋白吸附溶液滴加在基础电极的表面，干燥后得到预处理电极。

10、进一步地，所述参比电极、对电极和基础电极的材质相同。

11、本发明中的参比电极、对电极和基础电极均为材质相同的极片构成，可以采用一次性电极，一次性电极可以是丝网印刷碳电极、丝网印刷石墨烯电极和镀膜金电极等等。

12、进一步地，所述抗坏血酸氧化酶溶液由抗坏血酸氧化酶和含有质量分数为0.53％-4.93％的酶保护成分的酶保护液混合配制而成；所述抗坏血酸氧化酶溶液中抗坏血酸氧化酶的含量为0.01u/μl-2u/μl。

13、本发明利用抗坏血酸氧化酶溶液中的抗坏血酸氧化酶的专一性，抗坏血酸氧化酶具有专一性，并且在催化反应过程中不释放或消耗电子，因而不会产生可被捕捉的电信号。

14、进一步地，所述酶保护液为酶保护成分和ph为5.5-7的水性缓冲液溶解混合配制而成。

15、进一步地，所述酶保护成分由牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素钠、proclin-300中的一种或几种组成。

16、进一步地，所述抗蛋白吸附溶液由非离子表面活性剂和水性缓冲液混合配制而成；所述抗蛋白吸附溶液中非离子表面活性剂的质量分数为0.1％-2％。

17、本发明通过非离子表面活性剂对基础电极进行修饰，增加基础电极表面的亲水性，减少蛋白质在基础电极表面的非特异性吸附。

18、进一步地，所述水性缓冲液的ph为5.5-7；所述水性缓冲液为0.01m的pbs缓冲液、0.05m的柠檬酸盐缓冲液和0.2m的tris-hcl缓冲液中的一种。

19、作为本发明的一种优选技术方案，所述的一种生物传感器在维生素c检测方面的应用，包括以下步骤：

20、s1、向生物传感器工作电极上滴加定标液，通过信号处理系统施加氧化电位，获取定标液产生的电流值，记作i；

21、所述定标液为已知维生素c浓度的溶液，所述维生素c浓度，记作n；

22、s2、利用若干组不同维生素c浓度的定标液进行测定，获取若干组电流值，将若干组维生素c浓度与若干组电流值进行线性拟合，得到线性方程，所述线性方程为：i＝xn-y，其中x，y均为常数，相关系数为r2；

23、所述线性方程与所述电极系统的材质相关联；

24、s3、按照步骤s1，获取待测溶液产生的电流值，利用步骤s2的线性方程进行计算，即可得到待测溶液中维生素c的浓度。

25、本发明首先利用维生素c(l-抗坏血酸)的电化学活性，在工作电极上施加一定氧化电位(通过电化学工作站施加)后，可使得维生素c氧化并释放电子，机理如下：

26、

27、然后，本发明利用上述制备的生物传感器，酶修饰电极上负载的抗坏血酸氧化酶可专一性的催化维生素c，并且在催化反应过程中不释放或消耗电子，因而不会产生可被捕捉的电化学氧化信号，抗坏血酸氧化酶的作用机理如下：

28、

29、最后，本发明利用信号处理系统(电化学工作站)施加氧化电位，测得预处理电极上的信号为干扰物+维生素c的电化学氧化信号总和，酶修饰电极仅产生干扰物的电化学氧化信号，二者差分处理则可精确获得维生素c的电化学氧化信号，然后，利用电化学氧化信号与定标液中维生素c的浓度进行线性拟合，得到线性方程，再利用线性方程测定复杂溶液中的维生素c浓度。

30、进一步地，步骤s1中所述氧化电位为+0.3v-+0.8v，电位施加时间为5-10s。

31、本发明中氧化电位的选择需要依据参比电极、对电极和工作电极所用的材料进行调整，如使用的是活性较高的极片，则氧化电位可以适当更低一些；若极片的活性低，则氧化电位就需要更高一些，保证维生素c在电极表面反应充分。

32、进一步地，当基础电极为丝网印刷碳电极时：

33、x＝6.387；y＝-23.684；r2＝0.994；

34、线性方程为i＝6.387n-23.684，相关系数r2＝0.994。

35、进一步地，当基础电极为丝网印刷石墨烯电极时：

36、x＝0.0061；y＝+0.907；r2＝0.998；

37、线性方程为i＝0.0061n+0.907，相关系数r2＝0.998。

38、进一步地，当基础电极为镀膜金电极时：

39、x＝1.232；y＝+2.04；r2＝0.995；

40、线性方程为i＝1.232n+2.04，相关系数r2＝0.995。

41、本发明的有益效果：

42、(1)本发明采用双工作电极(预处理电极和酶修饰电极)、参比电极、对电极的四电极体系和信号处理系统(电化学工作站)构建了生物传感器。本发明的生物传感器中，预处理和酶修饰处理过程操作简单，原料易得且价格便宜，因此，本发明中的生物传感器具有构建方法简单和易于批量生产的优势。

43、(2)本发明利用生物传感器测定维生素c浓度，通过信号处理系统(电化学工作站)施加氧化电位，获取酶修饰电极的信号为干扰物+维生素c的电化学氧化信号，预处理电极仅产生干扰物的电化学氧化信号，二者差分处理则可精确获得维生素c的电化学氧化信号，再通过归纳和线性拟合，获得了维生素c浓度与电流值的线性方程，通过利用分光光度计验证了线性方程的可靠性，本发明的检测方法简洁高效，同时，经过实验验证，本发明的检测方法可避免如尿酸、多巴胺、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸等的干扰，可用于复杂体系中维生素c的定量检测。