一种检测Cyfra21-1的光电化学生物传感器及其制备方法

本发明涉及一种检测cyfra21-1的光电化学生物传感器及其制备方法，更具体地说是涉及一种基于碳化钛/类石墨相氮化碳/硒化镉量子点纳米复合材料修饰电极的光电化学生物传感器。

背景技术：

1、随着科技和经济的快速发展，环境污染可能导致癌症的问题引起了人们的深刻思考。根据既往报道，肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤，也是导致死亡的主要原因。它分为两种组织学类型：非小细胞肺癌(nsclc)和小细胞肺癌(sclc)。nsclc是肺癌的主要类型，约占所有肺癌的80-85％[zhang,y.y.,wu,t.t.,cui,q.q.,qu,z.f.,zhang,y.,ma,h.m.,wei,q.,biosens.bielectron.,2023,222,114992.]。由于患者在诊断时往往处于晚期，因此nsclc的转移和复发是肺癌患者死亡的主要原因[wang,y.f.,li,y.x.,zhuang,x.m.,tian,c.y.,fu,x.l.,luan,f.,biosens.bielectron.,2021,190,113371.]。作为nsclc的肿瘤标志物，细胞角蛋白21-1(cyfra21-1，cytokeratin-19片段)被认为是检测nsclc，尤其是鳞状细胞癌最重要的生物标志物[yang,y.c.,liu,m.h.,yang,s.m.,chan,y.h.,acssens.,2021,6,4255-4264.]。到目前为止，虽然已经发展了各种检测cyfra21-1的分析方法，如电致化学发光、电化学、表面等离子体共振、荧光等，但仍然存在灵敏度有限、操作复杂等限制。因此，开发一种简单、快速、高灵敏度的血清cyfra21-1检测方法对早期临床诊断具有重要意义。

2、光电化学生物分析是一种新兴的生物分析技术，它是利用光在被分析物、光活性物质和电极之间的光诱导电子转移过程实现的。因其检测周期短、背景信号低、灵敏度高而被应用于肿瘤标志物的检测[wu,t.t.,yu,s.q.,dai,l.,feng,j.h.,ren,x.,ma,h.m.,wang,x.y.,wei,q.,ju,h.x.,acssens.,2022,7,1732-1739.]。基于上述特点，提出了一种新的光电化学生物分析方法应用于cyfra21-1的敏感检测。

3、过渡金属碳/氮化物(mxenes，m＝过渡金属，x＝c,n,c/n,enes＝修饰基团)是一种具有可调光学和电子带隙的二维层状材料，具有比表面积高、活性位点丰富、电子传输效率高、理化特性可调、可变层间距和优异光电性能等优势[khan,k.,tareen,a.k.,iqbal,m.,ye,z.,xie,z.j.,mahmood,a.,mahmood,n.,zhang,h.,small,2023,2206147.]。mxenes的独特结构使其作为光电活性材料在传感领域备受关注：首先，内部导电过渡金属碳/氮化物层可实现电子的高效传递；其次，表面丰富的过渡金属氧化物作为快速氧化还原反应活性位点可以实现高效的光电催化活性；最后，二维材料固有的较大表面积有助于解决传感监测应用中检测限较高的问题，提升灵敏度[sunantha,g.,chamorn,c.,mohan,g.,dao,j.,foodchem.toxicol,2022,168,113377]。然而，自然水状态下，mxenes非常容易氧化，同时层间范德华力导致的堆叠团聚限制了其在光电化学传感领域的应用。为了克服上述问题并提高材料的光电转换效率，必须对其进行功能化修饰，使其在光电化学领域可以得到更好地应用。

4、目前有文献报道，界面异质结工程对于抑制载流子重组、提升光电转换效率至关重要。类石墨相氮化碳是一种非金属半导体光电活性材料，近些年来因其制备简单、环境友好、化学性质稳定性而被认为是最有前途的材料[liu,j.,yu,y.,qi,r.l.,cao,c.y.,liu,x.y.,zheng,y.j.,song,w.g.,appl.catal.benviron.,2019,244,459-464.]。此外，与半导体耦合是获得更好光电性能的常用方法，这可以有效减少光生电子-空穴对的复合。半导体量子点不仅具有较强的光吸收性，而且随着组成、形状和大小的变化而产生红移或蓝移。其中，cdse量子点因其能带隙窄、光吸收范围宽、能快速生成光生电子空穴对等优点，在光电化学生物分析领域得到了广泛应用[tang,y.y.,chen,j.s.,liu,x.p.,mao,c.j.,jin,b.k.,microchem.j.,2022,181,107773.]。

5、本发明将碳化钛、类石墨相氮化碳及硒化镉量子点结合起来，制备碳化钛/类石墨相氮化碳/硒化镉量子点纳米复合材料修饰电极，可充分发挥纳米复合材料优点，扩大光谱吸收范围，提高光能利用率并增强稳定性，是发展光电化学生物分析的新型策略，在生物分析和临床诊断等领域将会有广阔的应用前景。

技术实现思路

1、本发明为解决上述现有技术所存在的不足之处，提供一种基于碳化钛/类石墨相氮化碳/硒化镉量子点纳米复合材料的检测cyfra21-1的光电化学生物传感器及其制备方法，以期可以以高光电化学电流、高生物相容性的光电化学生物传感器实现对cyfra21-1的简单、快速的检测。

2、本发明解决技术问题采用如下技术方案：

3、本发明首先公开了一种检测cyfra21-1的光电化学生物传感器，其特点在于：所述光电化学生物传感器是在fto玻璃电极的表面覆盖有碳化钛/类石墨相氮化碳/硒化镉量子点纳米复合材料，在所述碳化钛/类石墨相氮化碳/硒化镉量子点纳米复合材料的表面固定有探针序列，所述探针序列可与单链核酸序列部分结合，所述单链核酸序列通过其末端修饰基团与信号放大因子连接。

4、进一步地，所述碳化钛/类石墨相氮化碳/硒化镉量子点纳米复合材料的制备方法为：在类石墨相氮化碳中加入纯水得到分散液，然后依次加入硒化镉量子点溶液和碳化钛分散液，超声分散均匀，即获得碳化钛/类石墨相氮化碳/硒化镉量子点纳米复合材料的分散液。具体步骤如下：

5、步骤1、将块状氮化碳分散在纯水中并超声处理，所得分散液高速离心处理，取所得固体放入反应釜中并加入浓硝酸，高温反应后将所得产物加入纯水并超声处理，然后离心洗涤至中性，得到类石墨相氮化碳，烘干备用；

6、步骤2、向步骤1所得类石墨相氮化碳中加入纯水得到分散液，再向所得分散液中加入硒化镉量子点溶液，超声均匀并放置过夜；然后向所得均匀混合液中加入碳化钛分散液，超声均匀并放置过夜后，即得碳化钛/类石墨相氮化碳/硒化镉量子点纳米复合材料的分散液。

7、进一步地，所述信号放大因子是按如下方法获得：取硝酸银和硝酸铟并加入纯水搅拌溶解，然后加入巯基丙酸并调节ph至9-10，惰性气体保护下加入硫化钠并高温回流，反应结束后产物沉降过夜并离心洗涤，即获得信号放大因子。其中，硝酸银、硝酸铟、纯水、巯基丙酸及硫化钠的用量比为0.1mmol：0.4mmol：50ml：0.1mmol：0.6mmol。

8、进一步地，所述高温回流的温度为100℃、反应时间为2h。

9、进一步地：所述探针序列可以与单链核酸序列及cyfra21-1识别；所述单链核酸序列会与探针序列碱基互补配对，且其结合能力弱于cyfra21-1。具体的，本发明中，所述探针序列为5’-gaagggaggaatggtgtcaggggcgagggtttttt-sh-3’，所述单链核酸序列为5’-nh2-cgcccctgacaccattcct-3’。

10、本发明所述的检测cyfra21-1的光电化学生物传感器的制备方法，是按如下步骤进行：

11、步骤1、将fto玻璃电极依次用丙酮、水和乙醇超声清洗，然后干燥，备用；

12、步骤2、在步骤1清洗好的fto玻璃电极表面均匀滴加碳化钛/类石墨相氮化碳/硒化镉量子点纳米复合材料的分散液，室温晾干后，得到碳化钛/类石墨相氮化碳/硒化镉量子点纳米复合材料修饰电极；

13、步骤3、在步骤2所制备的修饰电极表面滴加探针序列，低温温育后用磷酸缓冲溶液冲洗；然后向其表面滴加单链核酸序列，恒温温育后用磷酸缓冲溶液冲洗；将信号放大因子常温活化后滴加在电极表面恒温条件下与单链核酸序列通过基团连接，磷酸缓冲溶液冲洗后即得到检测cyfra21-1的光电化学生物传感器。

14、进一步地，步骤3中，所述低温温育的温度为4℃、时间为12-13h，所述恒温温育的温度为37℃、时间为70-80min。

15、利用上述生物传感器检测cyfra21-1的方法为：

16、步骤a、向所述光电化学生物传感器表面滴加待测cyfra21-1样品并恒温温育，然后取出并用磷酸缓冲溶液冲洗，得到待测生物传感器电极；cyfra21-1与探针序列具有更强的特异性识别能力，可将修饰有信号放大因子的单链核酸序列竞争剪切；

17、步骤b、将步骤1所得的待测生物传感器电极在含有0.1mol/laa的磷酸缓冲溶液中进行光电化学测试，获得待测cyfra21-1样品的光电流强度，利用光电流强度与cyfra21-1样品浓度的标准关系曲线，判断待测cyfra21-1样品的浓度。

18、进一步地，所述标准关系曲线是通过对以浓度在0.001-100pm范围内的一系列标准cyfra21-1样品制成的待测生物传感器电极进行光电化学测试，获得各浓度cyfra21-1样品所对应的光电流强度，然后以cyfra21-1样品的浓度的对数值为横坐标、以光电流强度为纵坐标进行拟合获得。如图1所示：各线条所对应浓度从左到右为：0.001pm、0.01pm、0.1pm、1pm、10pm、100pm；标准关系曲线为i(μa)＝15.0047-2.3906logccyfra21-1/pm。检测表明当cyfra21-1样品浓度在0.001-100pm范围内，光电流强度随着cyfra21-1样品浓度的升高而降低，与浓度成线性关系，检测限达到0.73fm。

19、所述光电化学测试是以所述待测生物传感器电极为工作电极、以pt电极为对电极、以饱和氯化银电极为参比电极的三电极体系，以250w氙灯为光源，波长范围为280-1000nm，外加电压为0v，用chi660d型电化学工作站记录电流变化。

20、与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：

21、1、本发明通过光电化学生物传感器实现了对cyfra21-1的检测，方法简单、检测范围广、灵敏度高、易于操作；

22、2、本发明对cyfra21-1的检测方法所需样品量少，检测成本低；

23、3、本发明通过碳化钛/类石墨相氮化碳/硒化镉量子点纳米复合材料制备光电化学生物传感器，光电化学电流高、生物相容性好，且具有极好的稳定性。