一种基于NH2-MIL-88(Fe)@Ru(bpy)32+构建的三重增强电致发光传感器的制备方法

本发明涉及基于nh2-mil-88(fe)@ru(bpy)32+构建的三重增强电致发光传感器的制备方法，具体是nh2-mil-88(fe)@ru(bpy)32+作为发光体，au@s@p@mo2c纳米网格作为底物增强材料，制备了一种检测癌胚抗原的增强型电致发光传感器，属于新型功能材料与生物传感检测。

背景技术：

1、癌胚抗原是人类肿瘤细胞产生的一种糖蛋白，人体内许多肿瘤的形成往往导致癌胚抗原高水平表达。大量报告表明，在一些癌症患者中，血清癌胚抗原水平明显升高，如大肠癌、乳腺癌和肺癌等。因此，建立一种快速、准确地检测癌胚抗原的分析方法非常必要。目前已有的癌胚抗原的检测方法有很多，如吸附、荧光分析、电化学分析等，但均存在检测效率低，可控性差，灵敏度低等问题。本发明设计了一种新型的三重增强型电致发光传感器，信号增强型分析方法检测灵敏度高，稳定性好，分析速度快，本发明设计的三重增强型电致发光传感器对癌胚抗原的检测限达到38.9 fg·ml-1。

2、nh2-mil-88(fe)@ru(bpy)32+是由金属有机框架nh2-mil-88(fe)封装发光团ru(bpy)32+制备而成的具有高稳定性和高强度ecl响应的发光体。而nh2-mil-88(fe)表面含有大量氨基基团，因此在充当载体的同时它表面的氨基又可以催化共反应剂k2s2o8生成so4·-，在ru(bpy)32+周围富集大量so4·-减少了so4·-与ru(bpy)32+之间物质传递和能量传递的损失，显著增强电致发光信号。本发明选择nh2-mil-88(fe)@ru(bpy)32+作为信号探针，au@s@p@mo2c纳米网格作为一抗标记物底物增强材料，金纳米颗粒可以提高电子转移效率，同时mo+6/mo+4活性位点转换也可以催化k2s2o8生成so4·-，s和p双掺杂mo2c产生更多暴露的活性中心和表面缺陷促进了电子传输进一步增强电致发光信号，能够实现包覆少量发光团ru(bpy)32+也能获得高强度的ecl响应，使得该传感器的检测灵敏度大大提高。

3、电致化学发光是一种由电化学反应引起的发光现象，是化学发光与电化学的结合体，以其高灵敏度、快速和低背景的优点在生物传感领域受到越来越多的关注。本发明基于nh2-mil-88(fe)@ru(bpy)32+成功构建了检测癌胚抗原的三重增强型光电化学传感器。该传感器以au@s@p@mo2c纳米网格作为基底增强材料，以nh2-mil-88(fe)@ru(bpy)32+信号探针作为第二抗体标记物，实现了对癌胚抗原的灵敏检测。本发明制备的电致发光传感器，具有低成本、高灵敏、特异性好、快速检测、易于制备等优点，实现了使用少量发光物就能实现高稳定性以及高强度发光响应，有效优化了目前检测癌胚抗原的技术手段。

技术实现思路

1、本发明目的之一是利用多孔的金属有机框架材料mofs来包覆发光团ru(bpy)32+，该发光团性能优异但易溶于水，从而造成发光信号不稳定，将其包覆到多孔道的mofs材料中极好的解决了易溶于水的缺陷，保留了发光性能优异的优点；

2、本发明目的之二是利用携带氨基的有机配体二氨基对苯二甲酸和三价铁离子为金属中心离子制备的nh2-mil-88(fe)，其尺寸小、形貌均匀且为对称的八面体结构，能够稳固包覆发光团，且nh2-mil-88(fe)表面富含氨基，因此在充当载体的同时它表面的氨基既可以作为结合二抗的活性位点，又可以催化共反应剂k2s2o8生成so4·-，在ru(bpy)32+周围富集大量so4·-减少了so4·-与ru(bpy)32+之间物质传递和能量传递的损失，显著增强了电致发光信号，与不含氨基的mof框架作对比，发光信号增强1.3倍；

3、本发明目的之三是使用au@s@p@mo2c纳米网格为基底增强材料一抗标记物，s@p@mo2c纳米网格结构能够牢牢固定在电极表面，起到持续稳固的效果，且具有更大的比表面积和更优异的催化活性；

4、本发明目的之四是s和p双掺杂mo2c产生更多暴露的活性中心和表面缺陷促进了电子传输，其中mo6+/mo4+活性位点可以催化共反应剂s2o82-的还原，产生更多的so4·-，进一步增强了电致发光信号，在此基础上通过原位生长法在s@p@mo2c纳米网格丰富的比表面积上负载大量金纳米粒子，不仅能够促进电子转移提高电致发光信号，还能为结合一抗标记物提供丰富的活性位点；

5、本发明目的之五是三重的增强效果使得仅存在少量发光团ru(bpy)32+就能实现较强的电致发光信号，ru(bpy)32+合成困难，价格昂贵，此发明极大的节约了成本；

6、本发明目的之六弥补现有癌胚抗原检测技术的不足，提供一种基于nh2-mil-88(fe)@ru(bpy)32+构建的三重增强电致发光传感器的制备方法，该传感器能够快速检测癌胚抗原，具有灵敏度高、特异性强、重现性好的优点，检出限为38.9 fg·ml-1，线性范围0.1pg·ml-1 ~ 100 ng·ml-1。

7、1、一种基于nh2-mil-88(fe)@ru(bpy)32+构建的三重增强电致发光传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

8、（1）底物au@s@p@mo2c纳米网格的制备

9、将0.025 ~ 0.075 g三聚氰胺c3h6n6在磁力搅拌下溶解在40 ~ 120 ml 100 ℃水中，直至得到透明溶液，然后加入0.005 ~ 0.015 g钼酸铵(nh4)6mo7o24·4h2o，产生白色沉淀，直至溶液蒸干转移到烘箱中干燥10 min，刮取得到白色粉末，把得到的白色粉末用瓷舟盛装，放入马弗炉通氮气以5 ℃·min-1的升温速度到400 ℃保持30 min，再以10 ℃的速度到800 ℃保持加热6小时产生黑色粉末，之后将黑色粉末进一步研磨得到mo2c复合材料，取适量mo2c细粉末悬浮液在搅拌条件下加入1 ~ 3 ml植酸c6h18o24p6和1 ~ 3 ml硫酸h2so4，待其搅拌均匀后再加入5 ~15 ml氢氧化钠naoh溶溶，充分搅拌后转移至反应釜，180 ℃反应24 h，产物用蒸馏水和乙醇充分洗涤后于60 ℃的真空烘箱中烘干得到s@p@moc2；

10、取20 ~ 60 mg s@p@moc2溶于50 ~ 150 ml去离子水中，加入2 ~ 6 ml 1% 氯金酸haucl4和5 ~ 15 mg 聚乙烯吡咯烷酮pvp搅拌6 h，然后加入2 ~ 6 ml柠檬酸三钠c6h5na3o7和少量硼氢化钠nabh4搅拌24 h，离心收集产物，去离子水洗涤三次得到黑色产物au@s@p@mo2c；

11、（2）ab1-au@s@p@mo2c生物共轭体的制备

12、将1 ~ 3 mg au@s@p@mo2c分散在850 ~ 2550 μl 磷酸缓冲盐溶液ph为7.4的pbs中，加入50 ~ 150 μl 10 μg ml-1 ab2溶液，在4 ℃震荡过夜，离心去除上清液，将其分散在1 ~ 3 ml ph为7.4的pbs中，并在4 ℃下保存；

13、（3）信号探针nh2-mil-88(fe)@ru(bpy)32+纳米颗粒的制备

14、将250 ~ 750 mg二氨基对苯二甲酸nh2-bdc和370 ~ 1110 mg六水合三氯化铁fecl3·6h2o溶解于30 ~ 90 ml n,n-二甲基甲酰胺dmf中，然后再加入20 ~ 60 mg六水合三联吡啶钌ru(bpy)3cl2·6h2o搅拌30 ~ 90 min充分溶解，转移到高温反应釜中，120 ℃反应12 h，水热反应过后离心，dmf和乙醇分别洗涤三次得到棕黄色产物nh2-mil(fe)@ru(bpy)32+纳米颗粒；

15、（4）ab2-nh2-mil(fe)@ru(bpy)32+生物共轭体的制备

16、将2 ~ 6 mg nh2-mil(fe)@ru(bpy)32+分散在850 ~ 2550 μl ph为7.4的pbs、1 ~3 ml 0.5%的戊二醛ga中，在4 ℃下震荡3 h，然后离心除去多余的交联剂，加入50 ~ 150 μl 10 μg ml-1 ab2溶液，在4 ℃震荡过夜，离心去除未反应物质，加入100 ~ 300 μl的1%牛血清白蛋白bsa溶液，在4 ℃下振荡6 h，得到的ab2-nh2-mil(fe)@ru(bpy)32+生物共轭体，用ph为7.4的pbs洗涤多次，直到上清液变色，最后将其分散在1 ml ph为7.4的pbs中，并在4℃下保存；

17、（5）电致化学发光传感器的制备

18、1）用氧化铝浆液(1.0、0.3、0.05 μm)对裸玻碳电极(φ = 4 mm)进行抛光，然后在去离子水中进行超声处理，用乙醇冲洗，最后在氮气气氛中干燥，

19、2）滴加8 μl 0.4 ~ 1.2 mg ml-1 ab1-au@s@p@mo2c生物共轭体于gce表面，4℃保存至微湿，

20、3）在修饰电极表面滴加6 μl 1% bsa，4 ℃孵育2 h，阻断修饰电极表面的非特异性活性位点，

21、4）当玻碳表面即将干燥时，使用ph为7.4的pbs从电极表面冲洗掉多余的bsa，将6μl不同浓度的癌胚抗原cea滴加于修饰电极表面，4 ℃孵育2 h，使抗原与ab1特异结合，

22、5）当玻碳电极表面接近干燥时，用ph为7.4的pbs冲洗掉多余的cea，最后，在电极最上层滴加8 μl的2 ~ 6 mg ml-1 ab2-nh2-mil(fe)@ru(bpy)32+生物共轭体，通过特异性结合与抗原连接，用ph为7.4的pbs彻底冲洗样品以去除多余的生物共轭体。

23、2、如权利要求1所述制备方法制备得到的电致化学发光传感器的检测方法，其特征在于，步骤如下：

24、（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和银/氯化银电极为参比电极，铂电极为辅助电极，抛光修饰的玻碳电极为工作电极，在40 ~ 120 mmol·l-1 k2s2o8的0.1~ 0.15 mol·l-1 pbs (ph=6.0 ~ 8.5)缓冲溶液中进行测试；

25、（2）用时间-光强法对癌胚抗原进行检测，设置电压从-1.6 ~ -1.2 v到0 v连续循环电位扫描；

26、（3）检测过程中将光电倍增管设置为400 ~ 800 v，扫描速率为0.1 ~ 0.2 v·s-1，记录光强度，绘制工作曲线；

27、（4）将待测的癌胚抗原样品溶液代替癌胚抗原标准溶液进行检测。