一种供体试剂在诊断主体心肌损伤中的用途的制作方法

本发明属于化学发光分析领域，具体涉及一种供体试剂在诊断主体心肌损伤中的用途。

背景技术：

1、心血管疾病是危害人类健康及生命的严重疾病，已成为21世纪人类健康的头号杀手。其中，急性心肌梗死最常见、最危险。

2、心血管检验是整个心血管领域中的“瓶颈”学科，因为只有在尽可能短的时间内正确诊断疾病，才能早发现、早治疗，最大程度防止致残、致死后果，改善患者预后和生活质量。近年来，对于心血管生物标志物的研究日益深入，积累了大量临床经验和证据，逐步明确了它们的临床适应症和新的研究领域，推动了他们的临床应用。生物标记物的检测可直接影响心血管疾病患者的临床诊断、危险分层、治疗方案选择和预后判断。心肌标志物全称为心脏损伤早期标志物，是指心脏损伤后6小时内血中水平升高的标志物，是临床中诊断心肌梗死、心肌缺血、心衰等心脏疾病的重要检测指标，主要包括心肌肌钙蛋白i(ctnⅰ)、肌红蛋白(myo)、肌酸激酶同工酶(ck-mb)和n末端脑钠肽前体(nt-probnp)等。随着科技不断发展，血液中的心衰标志物检测被逐步应用于临床，给心血管疾病的早期诊断、预后转归提供了方法。例如：nt-probnp是bnp激素原分裂后没有活性的n-末端片段，与bnp相比，半衰期更长，更稳定，其浓度可以反映短暂时间内新合成的而不是贮存的bnp释放，因此更能反映bnp通路的激活。血浆nt-probnp水平随心衰程度加重而升高。在急性心衰的诊断中，nt-probnp有着重要意义。

3、目前，以上标志物已经被医院广泛接受。也有多种单独检测上述指标的试剂盒面市。但是目前采取的主流方法是非均相的测定方法(例如elisa和磁微粒化学发光法等)。虽然能够测定上述标志物，但是存在检测速度慢、检测灵敏度低、检测成本高等缺点。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种供体试剂在诊断主体心肌损伤中的用途，利用所述供体颗粒进行检测时，既有超高的灵敏度，又具有很宽的检测量程。

2、为此，本发明第一方面提供了一种供体试剂在制备用于体外诊断主体是否患有心肌损伤的方法所使用的试剂盒中的用途，其中所述方法包括：将来自主体的体液与受体试剂和供体试剂相接触，反应后生成待测混合物；用激发光至少一次激发所述待测混合物，检测由此产生的化学发光的信号强度；根据所述化学发光的信号强度定量计算所述体液中至少一种心肌标志物的浓度，从而判断主体是否患有心肌损伤；

3、其中，所述供体试剂包含能够在激发状态下生成活性氧的供体颗粒，所述供体颗粒包括第一载体，所述第一载体的内部填充有敏化剂，所述第一载体的表面化学键合特异性结合配对成员中的一员；

4、所述心肌标志物选自肌钙蛋白t、肌钙蛋白i、肌钙蛋白激酶同工酶、肌红蛋白、白介素6和乳酸脱氢中的一种或多种。

5、在本发明的一些实施方式中，所述第一载体的表面没有包被或连接有多糖物质，其直接化学键合特异性结合配对成员中的一员。

6、在本发明的另一些实施方式中，所述第一载体的表面带有键合官能团，所述键合官能团用于将特异性结合配对成员中的一员化学键合在所述第一载体的表面。

7、在本发明的一些实施方式中，所述键合官能团选自胺基、酰胺基、羟基、醛基、羧基、马来酰亚胺基和巯基；优选选自醛基和/或羧基。

8、在本发明的一些实施方式中，所述第一载体表面的键合官能团的含量为100～500nmol/mg，优选为200～400nmol/mg。

9、在本发明的一些实施方式中，所述第一载体的表面包被至少两个连续多糖层的涂层，其中第一多糖层与第二多糖层自发关联。

10、在本发明的另一些实施方式中，所述连续多糖层中的每一层自发地与前一多糖层中的每一层相关联。

11、在本发明的一些实施方式中，所述多糖具有侧基官能团，所述连续多糖层的所述官能团与所述前一多糖层的所述官能团所带电荷相反。

12、在本发明的另一些实施方式中，所述多糖具有侧基官能团，并且所述连续多糖层通过所述官能团与所述前一多糖层的所述官能团之间的反应与所述前一多糖层共价连接。

13、在本发明的一些实施方式中，所述连续多糖层的所述官能团在胺官能团和胺反应性官能团之间交替。

14、在本发明的另一些实施方式中，所述胺反应性官能团是醛基或羧基。

15、在本发明的一些实施方式中，所述第一多糖层自发地与所述第一载体相关联。

16、在本发明的另一些实施方式中，所述涂层的最外一层多糖层具有至少一个侧基官能团。

17、在本发明的一些实施方式中，所述涂层的最外一层多糖层的侧基官能团选自醛基、羧基、巯基、氨基、羟基和马来胺基中的至少一种；优选选自醛基和/或羧基。

18、在本发明的另一些实施方式中，所述涂层的最外一层多糖层的侧基官能团直接地或间接地化学键合特异性结合配对成员中的一员结合。

19、在本发明的一些实施方式中，所述多糖选自含有三个或更多个未修饰或修饰的单糖单元的碳水化合物；优选选自葡聚糖、淀粉、糖原、菊粉、果聚糖、甘露聚糖、琼脂糖、半乳聚糖、羧基葡聚糖和氨基葡聚糖；更优选选自葡聚糖、淀粉、糖原和聚核糖。

20、在本发明的一些实施方式中，所述第一载体的粒径选自100～400nm，优选为150～350nm，更优选为180～220nm。

21、在本发明的另一些实施方式中，所述第一载体为磁性或非磁性的，优选为非磁性的。

22、在本发明的一些实施方式中，所述第一载体的形状选自带、片、棒、管、孔、微滴定板、珠子、粒子和微球；优选为微球。

23、在本发明的另一些实施方式中，所述第一载体的材质选自天然的、人工合成的或改性天然存在的聚合物；优选为人工合成的聚合物。

24、在本发明的一些具体实施方式中，所述第一载体的材质选自琼脂糖、纤维素、硝化纤维素、醋酸纤维素、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、尼龙、聚丁酸乙烯或聚丙烯酸酯；优选选自聚苯乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯或聚丙烯酸酯。

25、在本发明的一些实施方式中，所述第一载体为聚苯乙烯乳胶微球。

26、在本发明的另一些实施方式中，所述敏化剂是光活化的光敏剂和/或化学活化的引发剂，优选为光活化的光敏剂。

27、在本发明的一些实施方式中，所述敏化剂选自亚甲基蓝、玫瑰红、卟啉、酞菁和叶绿素。

28、在本发明的另一些实施方式中，所述特异性结合配对成员选自抗体、抗体片段、配体、寡核苷酸、寡核苷酸结合蛋白、凝集素、半抗原、抗原、免疫球蛋白结合蛋白、抗生物素蛋白、亲和素或生物素所组成的一对能够相互特异性结合的物质。

29、在本发明的一些实施方式中，所述特异性结合配对成员为亲和素-生物素。

30、在本发明的另一些实施方式中，所述亲和素选自卵白亲和素、链霉亲和素、卵黄亲和素、中性亲和素和类亲和素，优选为中性亲和素和/或链霉亲和素。

31、在本发明的一些实施方式中，所述亲和素通过氨基与所述第一载体表面的醛基反应形成席夫碱的方式化学键合在所述第一载体的表面。

32、在本发明的一些实施方式中，控制所述供体颗粒在所述供体试剂中的粒径分布变异系数c.v值≥5％。

33、在本发明的另一些实施方式中，控制所述供体颗粒在所述供体试剂中的粒径分布变异系数c.v值≥8％；优选地，控制所述供体颗粒在所述供试剂中的粒径分布变异系数c.v值≥10％。

34、在本发明的一些实施方式中，控制所述供体颗粒在所述供体试剂中的粒径分布变异系数c.v值≤40％；更进一步优选地，控制所述供体颗粒在所述供体试剂中的粒径分布变异系数c.v值≤20％。

35、在本发明的另一些实施方式中，所述供体颗粒在所述供体试剂中的粒径分布呈现多分散性。

36、在本发明的一些实施方式中，所述供体颗粒在所述供体试剂中的浓度为10μg/ml～1mg/ml，优选为20μg/ml～500μg/ml，更优选为50μg/ml～200μg/ml。

37、在本发明的另一些实施方式中，所述供体试剂中还包括ph值为7.0～9.0的缓冲溶液，所述供体颗粒悬浮于所述缓冲溶液中。

38、在本发明的一些实施方式中，所述缓冲溶液中含有多糖，所述多糖选自含有三个或更多个未修饰或修饰的单糖单元的碳水化合物，优选选自葡聚糖、淀粉、糖原、菊粉、果聚糖、甘露聚糖、琼脂糖、半乳聚糖、羧基葡聚糖和氨基葡聚糖；更优选选自葡聚糖、淀粉、糖原和聚核糖。

39、在本发明的另一些实施方式中，所述葡聚糖的分子量分布mw选自10000～1000000kda，优选选自100000～800000kda，更优选选自300000～700000kda。

40、在本发明的一些实施方式中，所述缓冲溶液中葡聚糖的含量为0.01～1wt％，优选为0.05～0.5wt％。

41、在本发明的另一些实施方式中，所述受体试剂中的受体颗粒包括第二载体，所述第二载体的内部填充有发光组合物，所述第二载体的表面包被有至少一层多糖层，所述多糖层的表面连接有报告分子，所述报告分子能够与待测目标分子特异性结合。

42、在本发明的一些实施方式中，所述发光组合物包含化学发光化合物和金属螯合物。

43、在本发明的另一些实施方式中，所述化学发光化合物选自烯烃化合物，优选选自二甲基噻吩、双丁二酮化合物、二氧杂环己烯、烯醇醚、烯胺、9-亚烷基苍耳烷、9-亚烷基-n-9,10二氢化吖啶、芳基乙醚烯、芳基咪唑和光泽精以及它们的衍生物，更优选选自二甲基噻吩及其衍生物。

44、在本发明的一些实施方式中，所述金属螯合物的金属是稀土金属或viii族金属，优选选自铕、铽、镝、钐、锇和钌，更优选为铕。

45、在本发明的另一些实施方式中，所述金属螯合物包含选自下列的螯合剂：nha、bhht、bhhct、dpp、tta、nppta、nta、topo、tppo、bfta、2,2-二甲基-4-全氟丁酰-3-丁酮、2,2’-联吡啶、联吡啶基羧酸、氮杂冠醚、氮杂穴状配体和三辛基氧化膦以及它们的衍生物。

46、在本发明的一些具体实施方式中，来自主体的体液利用稀释液稀释后再与受体试剂和供体试剂相接触。

47、在本发明的一些实施方式中，所述化学发光的检测波长为520～620nm。

48、在本发明的另一些实施方式中，采用600～700nm的红色激发光进行激光照射。

49、在本发明的一些实施方式中，所述受体颗粒在受体试剂中的浓度为1ug/ml-1000ug/ml；优选为10ug/ml-500ug/ml；更优选为20ug/ml-200ug/ml。

50、在本发明的另一些实施方式中，所述活性氧为单线态氧。

51、在本发明的另一些实施方式中，所述来自主体的体液包括但不限于：血液、血清、血浆、痰液、淋巴液、精液、阴道粘液、粪便、尿液或脊髓液。

52、本发明的有益效果为：本发明提供一种供体试剂在制备用于体外诊断主体是否患有心肌损伤的方法所使用的试剂盒中的用途，所述供体试剂中的供体颗粒产生活性氧的效率高，活性氧在均相体系中更容易传递给受体颗粒，不易受其他物质的干扰，且所述供体颗粒本身的稳定性较高，在供体试剂中能够稳定存在，不容易失活。利用所述供体试剂进行检测时，既有超高的灵敏度，又具有很宽的检测量程。另外，所述供体试剂中的供体颗粒的生产成本较低，使用便捷，可以通用在各种检测项目中。