血栓调节蛋白化学发光检测试剂盒的制作方法

本发明涉及体外检测，尤其涉及血栓调节蛋白化学发光检测试剂盒。

背景技术：

1、血栓调节蛋白(thrombomodulin,tm)是一种存在于细胞膜表面的跨膜糖蛋白，由巨核细胞和内皮细胞合成，普遍分布于血管内皮细胞表面。tm与凝血酶结合后会降低凝血酶的凝血活性，而加强其激活蛋白c的活性，由于激活的蛋白c具有抗凝作用，因此tm是重要的凝血抑制因子。正常生理状态下，tm分布于细胞质膜表面，当血管内皮细胞受到损伤后，常常引起tm表达、分泌异常和释放入血液，引起血浆中血栓调节蛋白含量的变化。临床上血液tm含量的升高见于弥散性血管内凝血、急性心肌梗死和脑血栓等疾病，因此血栓调节蛋白含量的测定对于一些疾病的诊断和治疗具有重要的意义。

2、目前，测定血栓调节蛋白的方法主要是酶联免疫吸附法(elisa)和放射免疫分析法(ria)。但二者在实际应用中都存在一些缺陷，酶联免疫吸附法操作繁琐，耗时长、测试结果不稳定、重复性差，不方便随到随测和医院急诊；放射免疫分析法具有放射性污染，测试结果不稳定，且所需仪器较昂贵。因此，开发一种操作简单、能够快速准确检测血栓调节蛋白的试剂盒十分必要。磁性纳米颗粒具有比表面积大、分离清洗速度快、重现性好、可偶联标记等优点，已经有研究者将磁微粒作为检测载体应用于临床项目检测。以磁性纳米颗粒为基础的磁微粒化学发光免疫分析法(clia)将具有高灵敏度的化学发光测定技术和高特异性的免疫反应相结合，具有灵敏度高、线性范围宽、特异性高、测值稳定、高自动化等特点。磁微粒化学发光法结合磁分离技术、免疫分析技术和化学发光技术完成对特定抗原的定量测定，抗原首先与包被在磁珠表面的抗体1结合，形成稳定的抗原-抗体1复合物，酶标抗体进而与抗原其他位点结合形成双抗体夹心复合物，标记在抗体上的碱性磷酸酶催化水解发光底物发出光信号。光信号值与碱性磷酸酶浓度呈正相关，通过化学发光仪检测分析实现双抗体夹心复合物(抗原)的定量测试。

3、现有方法制备的羧基磁珠，工艺重复性差、产品质量不稳定，且抗原或抗体偶联率、上机检测结果不佳；tm磁微粒化学发光测定试剂盒多采用链霉亲和素-生物素或放射性元素标记，检测结果易受过量标记物干扰、具有放射性危害。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种血栓调节蛋白化学发光检测试剂盒。具体提供一种核壳式超顺磁性磁微粒的制备方法，以及包被血栓调节蛋白抗体1的磁微粒悬浮液(免疫磁珠)、碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体2(酶标抗体)的制备。

2、本发明提供了羧基磁珠的制备方法，包括将可溶性三价铁离子盐制成纳米微粒内核，用二氧化硅包被后与羧基化硅烷反应，磁分离后得到。

3、具体的，所述将可溶性三价铁离子盐制成纳米微粒内核的步骤包括将可溶性三价铁离子盐、乙酸钠、高分子聚合物与乙二醇和乙二胺混合溶液反应，磁分离后得到fe3o4纳米微粒；

4、所述高分子聚合物选自聚氧乙烯类、聚乳酸、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠中的任意一种，在本发明的实施例中，所述高分子聚合物为羧甲基纤维素钠；

5、所述反应的温度为180～300℃，反应的时间为6～12h，在本发明的实施例中，反应的温度为220℃，反应时间为8h。

6、具体的，所述二氧化硅包被纳米微粒内核的步骤包括将fe3o4纳米微粒用碱液重悬后与正硅酸乙酯反应，磁分离后得到二氧化硅包被的fe3o4纳米微粒；

7、所述正硅酸乙酯与fe3o4纳米微粒的质量比为1：(10～30)；

8、所述fe3o4纳米微粒重悬后的重悬液ph值为10～12，优选ph值为10.5；

9、所述正硅酸乙酯溶于乙醇中，所述正硅酸乙酯的浓度为10％；

10、所述反应的温度为25～50℃，优选为25℃，反应的时间为3～6h，优选为5h。

11、具体的，所述羧基化硅烷的制备方法包括将氨基硅烷与酸酐在无水溶剂中反应1～2h得到；

12、所述氨基硅烷与酸酐的摩尔比为1：(2～30)，优选为1:10；

13、所述氨基硅烷选自乙烯基三乙氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、乙烯基三(β-甲氧乙氧基)硅烷)、(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷中的任意一种，优选为乙烯基三(β-甲氧乙氧基)硅烷)；

14、所述酸酐选自己酸酐、苯硫代甲酸酐、苯磺酸酐、乙丙酸酐、环己甲酸酐、乙氯乙酸酐中的任意一种，优选为乙氯乙酸酐。

15、在相同的摩尔比例下，氨基硅烷和酸酐的种类会影响二氧化硅包被的fe3o4纳米微粒表面羧基修饰的数量和位点，进而影响抗体的偶联率，影响试剂盒的检测，因此本发明对不同氨基硅烷和酸酐进行了筛选，结果表明利用乙烯基三(β-甲氧乙氧基)硅烷)和乙氯乙酸酐制备的羧基磁珠偶联率最高，变异系数最小，优于其他氨基硅烷和酸酐制备的磁珠。

16、具体的，所述二氧化硅包被后的fe3o4纳米微粒与羧基化硅烷反应的步骤包括将羧基硅烷溶于无水乙醇后与二氧化硅包被的fe3o4纳米微粒反应2～6h，磁分离后得到；

17、所述反应的温度为25～50℃，优选为25℃，ph值为10～20，优选为11。

18、本发明提供了羧基磁珠，其由本发明所述制备方法获得。本发明提供的羧基磁珠表面羧基含量较高，有利于磁珠表面抗体的偶联。

19、利用本发明提供的羧基磁珠制备的免疫磁珠与市售磁珠制备的免疫磁珠相比，偶联率高且稳定，能够广泛应用于化学发光检测试剂盒的制备，因此本发明提供了所述羧基磁珠在制备化学发光检测试剂盒中的应用。

20、本发明还提供了血栓调节蛋白检测试剂盒，其包括利用本发明所述的羧基磁珠制备的免疫磁珠和酶标tm抗体；

21、所述免疫磁珠偶联tm抗体1；所述酶标tm抗体为碱性磷酸酶标记的tm抗体2；

22、具体的，所述tm抗体1和2包括单克隆抗体或具有fab活性的改性抗体片段、抗体、抗体片段多聚体，可与人tm表面抗原决定簇特异性结合，可来源于鼠、兔、羊、犬等动物，优选为鼠源单克隆抗体；

23、所述tm抗体1和2为市售抗体；

24、所述羧基磁珠与tm抗体1的质量比为(10～200)：1，优选为50:1；

25、所述碱性磷酸酶与tm抗体2的质量比为(0.5～10)：1，优选为1:1。

26、在一些具体的实施例中，所述羧基磁珠偶联tm抗体1可通过edc、edc/nhs、edc/sulfo-nhs等活化剂偶联，优选edc/sulfo-nhs。偶联步骤如下：

27、a)将磁微粒均匀分散在活化缓冲液中；

28、b)使用活化缓冲液溶解活化剂，加入到磁微粒混悬液中混合均匀，于室温条件下(10～30℃)孵育30min～2h，获得活化磁珠；

29、c)磁分离去除残留活化剂，加入交联缓冲液重新分散磁微粒；

30、d)使用交联缓冲液稀释tm抗体1，加入到活化后的磁微粒混悬液中，混匀后于4～30℃孵育0.5～12h；

31、e)磁性分离，向免疫磁珠中加入淬灭缓冲液，4～30℃孵育0.5～3h；

32、f)磁分离后使用储存缓冲液分散免疫磁珠，储存备用。

33、所述磁珠与活化剂的质量比为0.1:1～20:1，优选为20:1。

34、所述封闭剂可以是乙醇胺、牛血清白蛋白、酪蛋白、氨基酸等含有游离氨基的物质中的一种或几种。

35、所述的活化、交联缓冲液可以是mes缓冲液、硼酸缓冲液、pbs缓冲液、mops缓冲液、hepes缓冲液等不含氨基和羧基的缓冲液中的一种，优选mes缓冲液；

36、所述活化、交联缓冲液ph范围为5.5～7.0，优选为6.5。

37、所述储存缓冲液缓冲体系可以是mops缓冲液、tris-hcl缓冲液、pbs缓冲液、hepes缓冲液、甘氨酸缓冲液等中的一种，优选tris-hcl缓冲液。

38、所述储存缓冲液中含有牛血清白蛋白(bsa)、防腐剂nan3；

39、所述储存缓冲液ph范围为6.0～9.0，优选为8.0。

40、在另一些具体的实施例中，所述酶标抗体可通过戊二醛法、过碘酸钠法或异双功能试剂交联法等方法制备，优选异双功能试剂(sulfo-smcc)交联法。制备步骤如下：

41、a)使用酶标缓冲液溶解/稀释碱性磷酸酶，加入一定量的sulfo-smcc，于4～30℃温和孵育0.5～3h，产物脱盐后备用；

42、b)使用酶标缓冲液溶解/稀释tm抗体2，加入一定量的traut’s试剂，于4～30℃温和孵育0.5～3h后，加入0.5％～2.5％的甘氨酸溶液淬灭5min，产物脱盐后备用；

43、c)将活化后的碱性磷酸酶与巯基化后的抗体混合后，4～30℃条件下温和搅拌孵育2～30h，加入0.5～2.5％的半胱氨酸溶液封闭0.5～2h；

44、d)产物脱盐后置于储存缓冲液中储存备用。

45、所述碱性磷酸酶/抗体与sulfo-smcc质量比为2～30:1，优选为15:1。

46、所述碱性磷酸酶/抗体与traut’s质量比为20～250:1，优选为20:1。

47、所述的酶标缓冲液可以是mes缓冲液、硼酸缓冲液、pbs缓冲液等不含氨基和羧基的缓冲液中的一种，优选tris-hcl缓冲液。

48、所述酶标缓冲液ph为7.0～9.0，不同ph条件下抗体的空间结构不同，与碱性磷酸酶偶联的位点存在差异，制备过程中会形成具有不同立体结构的酶标抗体复合物，影响抗原的识别与结合，进而影响血栓调节蛋白的检测，ph优选为7.5。

49、所述储存缓冲液缓冲体系可以是mops缓冲液、tris-hcl缓冲液、pbs缓冲液、hepes缓冲液、甘氨酸缓冲液等中的一种，优选tris-hcl缓冲液。

50、所述储存缓冲液中含有牛血清白蛋白(bsa)、防腐剂nan3；储存缓冲液ph范围为6.0～9.0，优选为8.0。

51、本发明还提供了检测血栓调节蛋白含量的方法，包括利用本发明所述的试剂盒。

52、本发明提供的方法可为诊断目的的，也可为非诊断目的的。例如，包括对人体或动物体，或者离体的来自于人体或动物体的样品进行的以诊断为目的的检测方法；也包括对环境样品或者模拟样品进行的以科研或其他非诊断目的检测方法。

53、本发明制备了一种产品质量稳定、抗原或抗体偶联率高的羧基磁珠，并利用羧基磁珠作为载体、以碱性磷酸酶标记抗体，使用tm配对抗体捕获血浆样本中的抗原，通过与含有amppd或aps-5等发色底物的全自动免疫检验系统用底物液搭配使用完成定量检测，本发明所述的核壳式超顺磁性磁微粒抗体偶联率高，试剂盒性质稳定，测值重复性好。具体表现为：本发明制备的羧基磁珠产品质量稳定、抗原或抗体偶联率高，且制备工艺简单、操作安全可靠、易于控制，免疫磁珠和酶标抗体能够快速捕获样本中的抗原，试剂盒性质稳定，测值重复性好。

54、说明书附图

55、图1示不同酶标抗体组定标曲线图。