一种诊断和预测口腔鳞状细胞癌的系统

本发明涉及医药领域，具体涉及一种诊断和预测口腔鳞状细胞癌的系统。

背景技术：

1、口腔黏膜潜在恶性病变(oralpotentialmalignantdisorders，opmds)是发生于口腔黏膜，具有一定恶变潜质的病变或状态的总称，它类型各异、种类繁多且病程长，多为慢性疾病，包括口腔扁平苔藓(orallichenplanus，olp)、尼古丁口炎(nicotinestomatitis)、口腔白斑(oralleukoplakia，olk)、口腔红斑(oralerythroplakia，oek)以及口腔黏膜下纤维性变(oralsubmucousfibrosis，osf)等病变。

2、口腔癌在我国的发病率在3.6/10万-8.0/10万人之间，90％为口腔鳞状细胞癌(oralsquamous cellcarcinoma，oscc)，占全身恶性肿瘤发病率的3％，位居全身恶性肿瘤第六位。虽然目前oscc已经开展了以手术治疗为主，联合放疗、化疗等多学科综合序列治疗策略，但是患者5年生存率仍维持在60％左右，晚期oscc患者的5年生存率仅为15％。研究发现，相当一部分oscc来源于opmds，olk的癌变率约在0.13％-17.5％范围内，olp癌变率大约在1.18％-2.09％范围内，osf的癌变率大约在1.7％-7.6％范围内，而oek患者绝大多数发生癌变。虽然opmds癌变过程的确切机制尚未明确，但是对于opmds患者的早期诊断、早期治疗、监测以及对其恶变风险的评估都有助于减少口腔癌的发生。

3、口腔鳞状细胞癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，起源于口腔黏膜上皮细胞。晚期oscc患者预后较差，早期诊断和治疗可以改善oscc的预后。但由于oscc的异质性，目前尚无有效的生物标志物用于早期诊断。

4、oscc通常由口腔黏膜潜在恶性病变(oralpotentiallymalignantdisorders,opmd)发展而来。目前，opmd的癌变预测主要基于对h&e染色切片的观察确定的组织病理学分级，但组织病理学分级存在主观性，不同医生的诊断存在差异。而且活检属于有创检查，有些患者身体存在其他疾病而无法耐受活检手术；切取活检时微小的病变和较深层次的病变很容易漏检，若没有一次取到癌变组织，还有可能进行二次活检，且结果与病理医师阅片有很大的关系。有创的检测技术不适合作为opmds早期诊断及长期监测、回访的手段，积极探索opmds及癌变早期的无创检查、诊断具有重大意义。

技术实现思路

1、拷贝数变异(copynumberalteration,cna)是指在基因组中与参考序列相比，由删除、复制、插入、倒位、易位的dna片段组合而产生的染色体结构变异。cna所代表的基因组改变特征可以反映癌症的演变，cna的发生早于恶性组织病理学形态的出现。利用cna预测opmd的癌变风险可以降低和延缓oscc的发生，实现早期诊断和治疗，提高患者生存。

2、opmd病变的诊断通常来源于病理医生对小块活检组织的h&e染色进行判断。小块opmd组织在福尔马林固定石蜡包埋后大部分rna被破坏，因此，难以进行分子分析。

3、本发明利用激光捕获显微解剖可以对福尔马林固定石蜡包埋样本和新鲜样本精准取材到数百个细胞。然后，对这些少量细胞进行低深度全基因组测序，检测样本的cna。该技术准确地从组织病理切片中分离出少量细胞，保留了空间位置和病理形态，提高了分析的精准度。

4、本发明提供了一种诊断和预测口腔鳞状细胞癌的系统，其特征在于包括：组织切片染色系统、激光捕获显微切割系统、细胞裂解系统、低深度全基因组测序系统和cna评分计算系统；

5、其中组织切片染色系统将组织切片按苏木素浸染、分化、返蓝、伊红浸染的顺序进行苏木素和伊红(h&e)染色；

6、激光捕获显微切割系统包括leica显微切割系统，使用leica显微切割系统对染色切片上的组织和细胞进行激光捕获显微切割；

7、细胞裂解系统包括裂解缓冲液，所述裂解缓冲液包括：无核酸酶水、蛋白酶k、triton x-100、1mol/ltris-hcl、500mmol/lnacl和500mmol/ledta；

8、低深度全基因组测序系统包括tn5转座酶、pcr扩增系统、qubit系统(invitrogen,usa)和测序系统；

9、cna评分计算系统为计算样本中的基因组重排水平的系统；

10、cna评分≤2则癌变风险较低或者没有癌变风险；cna评分>2则存在癌变风险，且数值越大，癌变风险越大。

11、如上所述的一种诊断和预测口腔鳞状细胞癌的系统，其特征在于：所述组织切片染色系统，将每个样本切割出10μm厚的组织切片，在二甲苯中浸泡三次，每次20分钟，随后在梯度酒精溶液中水化各2分钟；用depc水冲洗后，切片按苏木素浸染、分化、返蓝、伊红浸染的顺序进行苏木素和伊红(h&e)染色。

12、如上所述的一种诊断和预测口腔鳞状细胞癌的系统，其特征在于：所述梯度酒精溶液水化是指100％乙醇2次——95％乙醇——80％乙醇——70％乙醇。

13、如上所述的一种诊断和预测口腔鳞状细胞癌的系统，其特征在于：在激光捕获显微切割系统中，通过在显微镜下观察组织细胞形态和位置，使用leica显微切割系统对染色切片上的组织和细胞进行激光捕获显微切割，每个获取的组织样本细胞数量为200-1000个。

14、如上所述的一种诊断和预测口腔鳞状细胞癌的系统，其特征在于：在细胞裂解系统中，将组织样本在20μl裂解缓冲液中，50℃裂解18h；所述裂解缓冲液的组成为18μl无核酸酶水，2μl蛋白酶k,0.8μl5％tritonx-100,0.6μl1mol/ltris-hcl,0.4μl500mmol/lnacl,0.2μl500mmol/ledta。

15、如上所述的一种诊断和预测口腔鳞状细胞癌的系统，其特征在于：在低深度全基因组测序系统中，使用tn5转座酶对裂解缓冲液中的dna进行碎片化，通过26次pcr扩增，并使用vahtsdna磁珠进行纯化；每个样品最终扩增产物约为1-3μg；使用qubit系统(invitrogen,usa)测定浓度；然后确定200到1000bp大小的片段构建文库；agilentfragment analyzer测定的低浓度或大小分布不正确的文库在测序前被确定为不合格并排除；然后在illuminahiseq4000测序仪和pe150上测序。

16、如上所述的一种诊断和预测口腔鳞状细胞癌的系统，其特征在于：在cna评分计算系统中，cna评分主要用来评估样本中基因组重排的水平，通过低深度基因组测序可以获得全基因组每个片段的拷贝数变异情况，对单个样本所有染色体片段的拷贝数变异进行统计，综合分析样本中所有发生拷贝数变异的染色体片段长度以及拷贝数变异幅度，即可得到单个样本的cna评分。

17、本发明通过cna评分系统，可以实现仅需很小的活检组织，就可以实现癌变风险或者口腔鳞状细胞癌的诊断和预测，且准确度极高。本发明提供了口腔鳞状细胞癌诊断和预测的客观指标，避免了在病理分级上由于不同医生，而存在的主观差异。