一种同步测定砂仁中乙酸龙脑酯、樟脑、龙脑含量的检测方法

本发明涉及成分检测，特别涉及一种同步测定砂仁中乙酸龙脑酯、樟脑、龙脑含量的检测方法。

背景技术：

1、砂仁是中国传统“四大南药”之一，属姜科植物，主要分布在中国的广东、海南、福建、广西等南方省份。现代药理研究表明，砂仁具有良好的抗溃疡、抗腹泻和促进胃肠运动的功效。砂仁的主要药效成分是乙酸龙脑酯。中国药典一部(2020年版)收载的中药砂仁，采用传统的性状和显微鉴别确定砂仁真伪，并以砂仁中乙酸龙脑酯1种成分含量作为质量指标。尽管目前《中国药典》指定的气相色谱(gc-fid)检测方法能够实现对砂仁中的乙酸龙脑酯进行定性和定量检测，但实际上砂仁还含有色素、脂肪酸、多糖、黄酮素、鞣质等成分，不能排除它们在色谱柱上保留时间与乙酸龙脑酯相邻或相同；另外这些色素、脂肪酸、多糖、鞣质等干扰成分还会在气相进样口处富集，不仅会降低gc-fid检测灵敏度，还会干扰检测的准确度。因此，目前仅以测定乙酸龙脑酯1种成分含量作为砂仁药材质量控制指标，在质量标准控制和检测方法都有待完善和提高。

2、实际上，砂仁挥发油中含量1％以上的除了乙酸龙脑酯外，还有樟脑、龙脑等其他成分。付琛等人对不同产地的阳春砂挥发油化学成分进行分析，结果表明道地药材阳春砂含量较高的前三位成分是乙酸龙脑酯、樟脑、龙脑。砂仁中除了乙酸龙脑酯具有镇痛抗炎的作用外，龙脑具有良好的促进药物吸收作用，樟脑具有镇痛、杀菌等功效作用。开发对砂仁中乙酸龙脑酯、樟脑、龙脑等有效药用成分多组分鉴定和测定，对于砂仁中药材的鉴定和质量控制具有重要意义。

3、砂仁中多组分成分的同步测定也得到了关注。鲁艺等人采用气相色谱(gc-fid)对砂仁精油中的乙酸龙脑酯、樟脑、龙脑等7中活性物质进行检测。huan等人采用气相色谱(gc-fid)结合傅里叶变换近红外光谱(nirs)对砂仁中乙酸龙脑酯、樟脑、龙脑3种药用成分进行同步测定。张芳等人分别采用gc-fid测定砂仁中的柠檬烯、樟脑、乙酸龙脑酯、龙脑，采用hplc测定槲皮素、表儿茶素、香草酸，在此基础上，再结合傅里叶变换红外光谱光谱学(fourier transform infrared reflection，ftir)和差示扫描量热法(differentialscanning calorimetry，dsc)建立了砂仁多组分检测指纹谱库。尽管以上方法都能实现对砂仁中多种药用成分的同步定量检测，但操作过程繁琐耗时。

4、gc-ms具有全扫描模式(scam)和选择性扫描(sim)模式。gc-ms全扫描模式可对指定质量范围内的离子进行扫描并记录其质谱图，扫描的质量范围覆盖被测化合物的分子离子和碎片离子的质量，能提供离子的质谱图、离子峰的准确质量、碎片离子峰强比等质谱信息，从而获得待测化合物的分子量和结构信息，并通过库检索进行定性鉴别的方法，该模式可用于识别未知物、方法开发和高浓度分析物的定性和定量；gc-ms选择性扫描模式可以针对已知确定的目标化合物选择性扫描特定离子，可以获得更高的灵敏度，适合于复杂样品痕量分析。气相质谱联用技术(gc-ms)已被广泛应用于复杂组分的分离与鉴定，其具有气相的高分辨率和质谱的高灵敏度，是生物样品中药物与代谢物定性定量的有效工具，也用于中药成分分析。

5、quechers(quick，easy，cheap，effective，ruggedandsafe)样品前处理方法是一种快速便捷的样品处理方法，最初是应用于蔬菜水果基质中多种农药残留检测的前处理，现在已经广泛应用于食品污染物和环境污染物提取净化前处理，但应用于中草药的有效成分测定尚无相关报导。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明的目的在于提出一种同步测定砂仁中乙酸龙脑酯、樟脑、龙脑含量的检测方法，采用gc-ms技术结合quechers前处理方法，建立了砂仁中乙酸龙脑酯、樟脑、龙脑有效药用成分同步定量定性检测方法。

2、首先通过全扫描模式确定目标化合物的定量和定性特征离子，再采用选择性对目标化合物的定量和定性特征离子扫描检测。与目前气相方法相比较，gc-ms不仅能和gc-fid方法一样能提供保留时间，还能提供选择性离子的质谱图、选择离子峰的准确质量、碎片离子峰强比等质谱信息，在定性上远比gc方法更可靠；在定量上，由于不采集非目标待测物之外的定量特征离子，其定量更准确。此外，由于采用n-丙基乙二胺(primary secondaryamine,psa)、十八烷基硅烷键合硅胶(ostade-cylsilane,ods或c18)、石墨化炭黑(graphitized carbon black,gcb)等净化材料在样品上机检测前进行净化，在不影响待测目标组分特征峰的响应的前提下，减少了样品中色素、多糖、鞣质等杂质在进样口、衬管等进样前端部分富集，不仅提高了检测的灵敏度还减少仪器维护频率和成本。

3、本发明的技术方案是这样实现的：

4、一种同步测定砂仁中乙酸龙脑酯、樟脑、龙脑含量的检测方法，包括以下步骤：

5、(1)供试品溶液母液的制备：取砂仁干果，粉碎，加入无水乙醇，涡旋，超声处理，离心，收集上清液，得供试品溶液母液；

6、(2)供试品溶液上机液的制备：取供试品溶液母液进行吸附净化处理，吸附净化材料为n-丙基乙二胺、十八烷基硅烷键合硅胶、石墨化炭黑和硫酸镁，吸附净化处理后，涡旋，离心，收集上清液，得供试品溶液上机液；

7、(3)混合标准溶液的制备：取樟脑、龙脑和乙酸龙脑酯的标准品，无水乙醇溶解，得混合标准溶液；

8、(4)进行gc-ms检测。

9、砂仁是姜科植物果实，除富含乙酰龙脑酯、樟脑等挥发性成分外，还含有色素、脂肪酸、多糖、鞣质等成分，这些成分易在进样口、衬管等进样系统的前端部位富集，会降低检测灵敏度，增加了仪器维护的频率和成本，又影响目标化合物检测准确度，因此砂仁提取液在上样检测前需净化处理。

10、n-丙基乙二胺(psa)吸附剂可通过其乙二胺n-丙基官能团的极性作用，吸附样品中的有机酸、脂肪酸和糖等干扰物；c18吸附剂可通过其在硅胶上键合了十八烷基官能团的非极性作用，吸附极性较弱的脂肪酸、烯烃类及甾醇类、色素等大分子基；石墨化炭黑(gcb)对叶绿素等色素以及固醇类杂质有很好的效果。

11、进一步的，步骤(1)中，按料液重量体积比为9～12g：20～30ml，在粉碎砂仁干果中加入无水乙醇，涡旋0.5～1.5min，以350～400w、50～55khz的条件进行超声处理15～25min后，5000～6000r/min离心8～12min。

12、进一步的，步骤(2)中，n-丙基乙二胺、十八烷基硅烷键合硅胶、石墨化炭黑和硫酸镁的质量比为1～2：1～2：0.15～1：3～4。

13、进一步的，供试品溶液母液和吸附净化材料的料液体积重量比为1～2ml：250～350mg。

14、进一步的，步骤(2)中，涡旋时间为0.5～1.5min，离心转速为10000～12000r/min，离心时间为3～8min。

15、进一步的，步骤(4)中，气相色谱检测采用程序升温，程序升温步骤包括如下：初始柱温55～65℃，保持0.5～1.5min，以4.0～6.0℃/min升至130～170℃，保持0.5～1.5min，最后以25～35℃/min升至260～300℃，保持1.5～2.5min。

16、更进一步的，色谱柱为hp-5ms，流速为0.8～1.2ml/min，进样方式为分流进样。

17、进一步的，步骤(4)中，质谱条件为：扫描时间4～16min，扫描离子范围60～160m/z。

18、更进一步的，择性监测模式(sim)：第一段扫描时间4.0～9.5min，扫描离子范围80～160m/z；第二段扫描时间9.5～12.0min，扫描离子范围60～160m/z；第三段扫描时间12.0～16.0min，扫描离子范围90～140m/z。

19、进一步的，采用电子轰击离子源，离子化能量为65～75ev，离子源温度为245～255℃，传输线温度为275～285℃，四极杆温度为145～155℃，溶剂延迟3.5～4.5min。

20、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

21、本发明通过优化提取和净化砂仁的方法，建立了quechers/气相-质谱联用同步测定砂仁中乙酸龙脑酯、樟脑、龙脑的方法，该方法前处理简单、便捷、灵敏度高，经方法学验证，加标回收率、精密度均能满足砂仁中乙酸龙脑酯、樟脑、龙脑含量检测要求，可用于砂仁中检测分析。