筛选人冠状病毒主要蛋白酶3CLpro抑制剂的方法

本发明属于药物筛选，尤其涉及一种筛选人冠状病毒主要蛋白酶3clpro抑制剂的方法。

背景技术：

1、在过去的几十年时间里，冠状病毒(covs)感染引起了多次严重的公共卫生问题。冠状病毒的感染，除了接种新冠疫苗外，临床上主要采取对症和支持治疗，尚没有特效药物，这导致了在应对新兴和重新出现的冠状病毒时缺乏药物和准确的应对策略。因此迫切需要建立一个高效的药物筛选系统，能够快速准确地筛选广谱抗冠状病毒药物，为临床治疗sars-cov-2提供药效学依据，同时为预防和应对冠状病毒的暴发提供药物支持。

2、hcov-oc43感染主要引起轻度上呼吸道症状，可通过患者的自身免疫治愈，无需特殊治疗，且与sars-cov-2同为β属冠状病毒，核苷酸和氨基酸序列的比较表明，这两种病毒在涉及病毒复制和发病机制的重要基序(如rdrp、解旋酶基序和3clpro)中具有广泛的同一性，且没有iii级生物实验室限制的缺点，因此是一个良好的高通量药物筛选模型。同时所有冠状病毒在3clpro编码区都显示出高度的同源性，且3clpro蛋白酶是冠状病毒在宿主中完成复制所必需的，因此抑制该靶标可以阻断病毒的生命周期并降低病毒活性。

3、pcdna3-flipgfp(hcov-oc43-3clpro cleavage)t2amcherry质粒能够表达基于绿色荧光蛋白(gfp)的衍生蛋白flipgfp和mcherry两种荧光蛋白，flipgfp只有在人冠状病毒-oc43(hcov-oc43)主要蛋白酶3clpro切割后才能表达绿色荧光，因此绿色荧光蛋白的表达强度可以指示3clpro蛋白酶的活性。将正常表达hcov-oc43主要蛋白酶3clpro的pcdna3.1-3clpro质粒和携带能够被hcov-oc43主要蛋白酶3clpro切割后产生绿色荧光的pcdna3-flipgfp(hcov-oc43-3clpro cleavage)t2amcherry质粒共同转染293t细胞，培养48h后检测绿色荧光蛋白表达量来预测3clpro蛋白酶的活性。由于mcherry的表达不受3clpro蛋白酶的影响，因此红色荧光蛋白的表达能够作为转染对照，且绿色荧光信号与红色荧光信号的比率与3clpro的酶活性成正比。

4、通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前针对冠状病毒的感染尚没有特效药物，而新的干预措施可能需要数年才能开发，导致在应对新兴和重新出现的冠状病毒时缺乏准确的应对策略。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种筛选人冠状病毒主要蛋白酶3clpro抑制剂的方法，尤其涉及一种高通量筛选人冠状病毒-oc43(hcov-oc43)主要蛋白酶3clpro抑制剂的方法。

2、本发明是这样实现的，筛选人冠状病毒oc43主要蛋白酶3clpro抑制剂的方法包括：构建被oc43主要蛋白酶3clpro切割后表达绿色荧光的pcdna3-flipgfp t2amcherry活性报告质粒以及oc43主要蛋白酶3clpro表达质粒pcdna3.1-3clpro，并按照质量比1:1共转染293t细胞；转染后培养48h，使用倒置荧光显微镜检测绿色荧光和红色荧光的表达量，以预测3clpro蛋白酶活性，进而实现筛选oc43主要蛋白酶3clpro抑制剂的目的。

3、筛选人冠状病毒主要蛋白酶3clpro抑制剂的方法包括以下步骤：

4、步骤一，3clpro活性报告质粒pcdna3-flipgfp t2amcherry的构建；

5、步骤二，oc43主要蛋白酶3clpro表达质粒pcdna3.1-3clpro的构建；

6、步骤三，利用3clpro活性报告质粒以及表达质粒共转染293t细胞；

7、步骤四，利用倒置荧光显微镜检测荧光信号并筛选3clpro抑制剂。

8、步骤一中的oc43主要蛋白酶3clpro活性报告质粒的构建是通过改造pcdna3-flipgfp(tev cleavage)t2a mcherry质粒，即使用3clpro切割位点tsfl↓qsgi将质粒当中携带的烟草噬裂病毒切割位点替换实现的，具体包括：

9、(1)设计含有3clpro切割位点tsfl↓qsgi(箭头处表示切割位点)的特异性引物，以pcdna3-flipgfpt2amcherry质粒作为模板进行扩增；

10、(2)扩增产物使用dpn i酶处理，以去除未产生突变的质粒；利用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收dpn i酶处理后的dna；

11、(3)转化至感受态细胞；挑取单克隆，提取质粒并进行测序验证，质粒构建成功后使用无内毒素质粒提取试剂盒提质粒。

12、步骤(1)中的质粒改造重组引物包括3clpro cleavage-f和3clprocleavage-r；其中，引物3clpro cleavage-f的核苷酸序列为seq id no:1，tm为72℃；引物3clprocleavage-r的核苷酸序列为seq id no:2，tm为72℃。

13、步骤二中的3clpro表达质粒pcdna3.1-3clpro的构建使用的载体是pcdna3.1质粒，oc43主要蛋白酶3clpro表达质粒的构建包括：

14、(1)从ncbi下载oc43主要蛋白酶3clpro编码dna序列，使用primer primer 5.0分析酶切位点并设计特异性引物；

15、(2)提取oc43的rna并逆转得到的cdna作为扩增模板，使用高保真酶(诺唯赞p510)扩增得到带有酶切位点的3clpro片段；

16、(3)使用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收目的片段；双酶切目的片段和载体，胶回收纯化片段；

17、(4)使用t4dna连接酶按照摩尔比1：1连接3clpro片段和载体，并转化到感受态细胞、挑单克隆；提取质粒并进行测序验证；提取无内毒素质粒。

18、上述步骤(1)中的oc43主要蛋白酶3clpro编码dna序列的genbank为on376724.1，pcdna3.1-3clpro表达质粒构建引物包括3clpro-f和3clpro-r；

19、其中，引物3clpro-f的核苷酸序列为seq id no:3，tm为53℃；引物3clpro-r的核苷酸序列为seq id no:4，tm为53℃。

20、进一步，步骤三中的3clpro活性报告质粒和表达质粒共转染293t细胞包括：

21、(1)分别设置对照组，不对细胞作任何处理；共转染组，按照1:1共转染3clpro活性报告质粒和表达质粒；单独转染3clpro活性报告质粒；

22、(2)转染前一天将密度为5×103cells/ml细胞铺96孔板，每孔加细胞悬浮液100μl；

23、(3)待细胞贴壁后，根据不同处理组进行转染，转染根据lipofectaminetm3000转染试剂说明书进行；

24、(4)转染后6h更换培养基继续培养。

25、本发明所使用的293t细胞为人肾上皮细胞，采用含10％血清、1％青链霉素、1％hepes的dmem完全培养基，于5％co2浓度37℃恒温培养箱培养得到。

26、步骤四中的荧光信号的检测包括：

27、(1)转染后48h将细胞上清弃去；

28、(2)使用pbs清洗细胞三次，加入新鲜培养基；

29、(3)使用倒置荧光显微镜检测红色以及绿色荧光信号。

30、本发明的另一目的在于提供一种实施所述的筛选人冠状病毒主要蛋白酶3clpro抑制剂的方法在筛选光谱抗冠状病毒药物中的应用。

31、结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：

32、第一，针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：

33、本发明提供的筛选人冠状病毒-oc43(hcov-oc43)主要蛋白酶3clpro抑制剂的方法，首先构建了hcov-oc43主要蛋白酶3clpro表达质粒pcdna3.1-3clpro和3clpro活性报告质粒pcdna3-flipgfp(hcov-oc43-3clpro cleavage)t2amcherry；其次，利用3clpro表达质粒pcdna3.1-3clpro和3clpro活性报告质粒pcdna3-flipgfp(hcov-oc43-3clpro cleavage)t2amcherry转染细胞，具体包括将状态良好的细胞按照5×103cells/ml密度铺于板中，待细胞贴壁，融合度达到60～70％后，将3clpro表达质粒以及活性报告质粒转染进入细胞；根据lipofectaminetm 3000转染试剂说明书将3clpro表达质粒以及活性报告质粒按照1:1的比例转染进细胞中；转然后48h换液，并使用倒置荧光显微镜检测gfp以及mcherry的发光情况，并通过绿色荧光表达量判断3clpro的活性。

34、本发明提供的高通量筛选人冠状病毒-oc43(hcov-oc43)主要蛋白酶3clpro抑制剂的方法，基于绿色荧光蛋白(gfp)的衍生蛋白(flipgfp)，该蛋白仅在人冠状病毒-oc43(hcov-oc43)主要蛋白酶3clpro切割后表达绿色荧光，因此绿色荧光蛋白的表达强度可以指示3clpro蛋白酶的活性。本发明将正常表达hcov-oc43主要蛋白酶3clpro的质粒和携带能够被hcov-oc43主要蛋白酶3clpro切割后产生绿色荧光的flipgfp的质粒共同转染293t细胞，培养48h后检测绿色荧光蛋白表达量，以指示3clpro蛋白酶的活性。本发明提供的主要蛋白酶3clpro抑制剂检测方法允许在生物安全ⅱ级实验室进行抗人冠状病毒-oc43(hcov-oc43)主要蛋白酶3clpro抑制剂的筛选，并具有高通量兼容的样品处理和分析，该检测方法为筛选光谱抗冠状病毒药物及临床治疗sars-cov-2提供药效学依据，同时为预防和应对冠状病毒暴发提供药物支持。

35、第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：

36、本发明提供的倒置荧光显微镜拍摄结果显示，当使用hcov-oc43主蛋白酶3clpro活性报告质粒pcdna3-flipgfp(hcov-oc43-3clpro cleavage)t2amcherry和hcov-oc4主要蛋白酶3clpro表达质粒pcdna3.1-3clpro按照1:1转染293t细胞时，成功检测到绿色荧光的表达。

37、第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下重要方面：

38、本发明的技术方案允许筛选大规模化合物，以高通量方式筛选针对冠状病毒的广谱药物，为sars-cov-2或其他cov的临床管理提供潜在的替代方案，解决了在应对冠状病毒疫情时缺乏有效的药物支持的难题，同时克服了生物安全ⅲ级实验室限制：

39、本发明技术以不被生物安全ⅲ级实验室限制的人冠状病毒oc43为模型，筛选冠状病毒要蛋白酶3clpro抑制剂，同时达到筛选广谱抗冠状病毒药物的目的，为临床治疗sars-cov2提供药效学依据，为预防和应对冠状病毒爆发提供药物支持。