一种便携式检测大肠杆菌O157：H7的方法

本发明涉及生物检测，尤其是涉及一种便携式检测大肠杆菌o157：h7的方法。

背景技术：

1、食源性疾病是影响全球健康的主要因素之一，每年造成数百万人发病，数千人死亡，损失巨大。大肠杆菌o157:h7是一种常见的食源性致病菌，可通过食品传播，对食品安全造成重大威胁，导致严重的疾病。因此，预防感染至关重要，通过检测及早发现污染源对预防疾病传染及爆发、保障我国食品安全具有重要意义。

2、当前检测细菌的方法主要有培养法、电化学传感法、pcr、荧光和拉曼光谱等。然而，技术复杂、仪器大型化，耗时长等，尤其不适用于家庭场景中的应用。血糖仪是较为成熟的便携式检测装置，操作简单、成本较低且易于携带，在日常生活中得到了广泛应用。

3、开发血糖仪非葡萄糖靶点的检测，如金属离子、毒素、细菌等显示出良好的应用前景。在这些非葡萄糖靶点检测中，将纳米酶固定在dna上作为信号探针，通过dna识别特定目标，利用酶将底物转化为葡萄糖，最终实现检测将成为具有前景的研究方向之一。

4、然而，由于dna杂交环境与天然酶最适活性条件的矛盾，如dna杂交需要在碱性溶液下进行，而天然酶在碱性环境中活性不佳。此外，天然酶易失活。这些因素降低血糖仪的准确性和灵敏度。纳米酶如金属氧化物、金属-有机框架可克服天然酶易失活、成本高等缺点，可替代天然酶。因此，发展纳米酶，结合dna的可设计性、特异性识别的特性，创建高效、准确的检测方法对于细菌的及时、快速检测具有重要意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种便携式检测大肠杆菌o157：h7的方法。

2、本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

3、一种便携式检测大肠杆菌o157：h7的方法，其按照下述步骤进行：采用柠檬酸钠溶液、四氯金酸溶液制备得到金纳米粒子，采用柠檬酸钠溶液、四氯金酸溶液和硼氢化钠溶液制备得到金种子；以金纳米粒子、sh-ini序列、与sh-ini序列部分互补的适体序列修饰酶标板，得到dna修饰金基底酶标板；以金种子为核，通过在其表面沉积金、铂后形成双金属纳米粒子au@auptnps；以sh-h1序列修饰au@auptnps得到au@aupt-h1，以sh-h2序列修饰au@auptnps得au@aupt-h2；将待测样品溶液、au@aupt-h1、au@aupt-h2在dna修饰金基底酶标板中孵育，当体系中存在大肠杆菌时，酶标板上修饰的适体序列与大肠杆菌发生特异性结合，暴露出sh-ini序列，触发au@aupt-h1和au@aupt-h2发生hcr反应，催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸和水，使葡萄糖浓度降低，从而将大肠杆菌浓度转化为葡萄糖浓度，结合便携式血糖仪实现对大肠杆菌的便携检测；

4、其中，所述sh-ini序列为：

5、5′-sh-(ch2)6-atacgggagccaacaccacgcatc-3′，

6、所述适体序列为：5'atccgtcacacctgctctgtctgcgagcggggcgcgggcccggcgggggatgcgtgg tgttggctcccgtat-3'，

7、所述sh-h1序列为：

8、5'-sh-(ch2)6-gagccaacaccacgcatccaaagtgatgcgtggtgttggctcccgtat-3，所述sh-h2序列为：

9、5′-actttggatgcgtggtgttggctcatacgggagccaacaccacgcatc-(ch2)6-sh-3′。

10、上述一种便携式检测大肠杆菌o157：h7的方法，其具体操作步骤如下：

11、(1)将1ml 1wt％四氯金酸溶液加入到100ml超纯水中，加热至沸，在剧烈搅拌下快速加入2.5ml 1wt％柠檬酸钠溶液，保持沸腾搅拌10min，此时溶液的颜色由灰一蓝一紫变为酒红色，移去热源后再继续搅拌10min，得到金纳米粒子溶液；取36ml超纯水和1ml 10mm四氯金酸溶液于100ml圆底烧瓶中，在室温搅拌条件下依次加入1ml 10mm柠檬酸钠溶液和1ml 100mm硼氢化钠溶液，室温搅拌1min，可观察到溶液变为橙红色，室温静置陈化4～5h，得到金种子溶液；

12、(2)酶标板中每孔加入100μl步骤(1)得到的金纳米粒子溶液和5μl 1μm mpeg-sh溶液，80℃干燥；再每孔加入50μl 10mm四氯金酸溶液和50μl 20mm盐酸羟胺溶液，室温孵育30min，超纯水洗板3次，拍干；再每孔加入100μl 7.5nm sh-ini序列溶液，室温孵育4h，tris缓冲液洗板3次，拍干；再每孔加入100μl 7.5nm适体序列溶液，室温孵育4h，tris缓冲液洗板3次，拍干；再每孔加入100μl 2wt％bsa溶液，室温孵育2h，tris缓冲液洗板3次，拍干，得到dna修饰金基底酶标板；

13、(3)取100ml步骤(1)得到的金种子溶液，向其中加入10ml氯金酸-氯铂酸混合溶液，然后缓慢加入5ml 80mm抗坏血酸溶液，室温搅拌1min，静置陈化5h，得到au@aupt nps溶液；

14、(4)将sh-h1序列用tris-hcl缓冲液溶解至终浓度为10μm，于95℃变性10min，再在冰上冷却10min，得到变性后的sh-h1溶液；将sh-h2序列用tris-hcl缓冲液溶解至终浓度为10μm，于95℃变性10min，再在冰上冷却10min，得到变性后的sh-h2溶液；取50μl步骤(3)得到的au@aupt nps溶液、2μl 20μm peg-sh溶液、2μl 1vol％吐温20溶液震荡混匀，加入3μl变性后的sh-h1溶液和20μl 1m nacl溶液，混匀后于37℃放置1h，离心，弃上清，向沉淀中加入250μl tris-hcl缓冲液，得到au@aupt-h1溶液；取50μl步骤(3)得到的au@aupt nps溶液、2μl 20μm peg-sh溶液、2μl 1vol％吐温20溶液震荡混匀，加入3μl变性后的sh-h2溶液和20μl 1m nacl溶液，混匀后于37℃放置1h，离心，弃上清，向沉淀中加入250μltris-hcl缓冲液，得到au@aupt-h2溶液；

15、(5)在步骤(2)得到的dna修饰金基底酶标板中每孔加50μl步骤(4)得到的au@aupt-h1溶液和50μl步骤(4)得到的au@aupt-h2溶液，37℃孵育2h，洗涤缓冲液洗板3次，拍干；再每孔加入50μl葡萄糖溶液(20mm)，室温孵育1h，而后采用便携式血糖仪(鱼跃医疗，660)对葡萄糖浓度进行检测，将该血糖仪读数记为y1；

16、(6)将不同浓度大肠杆菌o157：h7标准溶液按100μl/孔加入至步骤(2)得到的dna修饰金基底酶标板中，室温孵育30min，tris缓冲液洗板3次，拍干；而后每孔加入50μl步骤(4)得到的au@aupt-h1溶液和50μl步骤(4)得到的au@aupt-h2溶液，37℃孵育2h，洗涤缓冲液洗板3次，拍干；再每孔加入50μl 20mm葡萄糖溶液，室温孵育1h，后采用便携式血糖仪对葡萄糖浓度进行检测，将该血糖仪读数记为y2，建立大肠杆菌浓度与血糖仪读数变化值δy的对应关系并绘制标准曲线；其中，δy＝y1－y2；

17、其中，所述金纳米粒子的平均粒径为15nm，所述金种子的平均粒径为5nm，所述au@auptnps的平均粒径为8nm；

18、其中，所述氯金酸-氯铂酸混合溶液中氯铂酸：氯金酸的摩尔比为1：10～1：1；

19、其中，所述tris缓冲液配方为：10mm tris-hcl、300mmnacl、5mm mgcl2；ph＝7.4；

20、其中，所述tris-hcl缓冲液浓度为10mm，ph值为7.4；

21、其中，所述洗涤缓冲液配方为：10mm tris-hcl、300mm nacl、5mm mgcl2、0.05vol％吐温20；ph＝7.4；

22、其中，所述建立大肠杆菌浓度与血糖仪读数的对应关系是指：以大肠杆菌标准溶液浓度的对数为横坐标，δy为纵坐标，绘制得到检测大肠杆菌o157:h7的标准曲线。

23、本发明的显著优点在于：

24、本发明结合了dna修饰的au@aupt nps兼具葡萄糖氧化酶活性和核酸适体特异性识别大肠杆菌o157：h7的能力，进一步结合hcr反应，将信号显著放大，最后用血糖仪进行检测。该方法具有操作简便、灵敏度高、重现性好、选择性高以及易于推广，适用于对大肠杆菌o157：h7的测定。