一种血小板交叉配型的方法与流程

本发明属于血小板检测领域，具体涉及一种血小板交叉配型的方法。

背景技术：

1、随着临床血小板输注量逐年增长，血小板输注无效（ptr）已成为国内外临床极为棘手的问题。在免疫因素引起的ptr中，血小板特异性抗体（hpa）和组织相容性抗体（hla）是引起ptr的主要原因。然而hpa种类多，hla又具有高度多态性，要每次输注都找到hpa和hla完全相容的血小板是不现实的，因此要解决由免疫因素引起的输注无效的较为安全有效的方法是输注hpa和hla相容的血小板。因此，在血小板输注前进行血小板交叉配型具有必要性。

2、现有的血小板抗体检测技术主要包括以下几类：血小板黏附免疫荧光试验（paift）、微柱凝胶技术、maipa、免疫细胞化学法（sabc）、简易致敏红细胞血小板血清学实验（sepsa）放射免疫微球法和流式细胞仪（fcm）技术等，但都存在各自的局限。基于流式细胞技术发展起来的流式微球技术目前被广泛用于血小板的抗体检测中。其基本原理是利用包被有特异性单克隆抗体的检测微球捕获特定的血小板膜糖蛋白，然后与待检样本孵育后，再与fitc标记的羊抗人多克隆抗体孵育，如果血小板膜糖蛋白上结合有血小板特异性自身抗体，就会形成检测微球-血小板膜糖蛋白-血小板特异性自身抗体-fitc标记的羊抗人多克隆抗体复合物，流式细胞仪检测表现为检测微球荧光强度增高，从而进行辨别。但是，目前微球主要还是用于血小板抗体的检测，而用于血小板交叉配型尚未见报道。

3、基于此，本发明提供一种新的血小板交叉配型的方法，以期缓解现有技术的不足。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种用于血小板交叉配型的磁性血小板吸附复合物和一种血小板交叉配型的方法，具体技术方案如下。

2、一种用于血小板交叉配型的磁性血小板吸附复合物，其组成包括亲和素磁珠和生物素-rgd肽；其中所述生物素-rgd肽由生物素上噻吩环侧链末端的羧基与rgd肽上的氨基缩合形成或直接化学合成，1个生物素与1个rgd肽偶联；所述亲和素磁珠上活化的色氨酸残基与生物素的咪唑酮环共价结合形成所述磁性血小板吸附复合物，所述亲和素磁珠上的每个亲和素可以结合4个生物素-rgd肽。

3、生物素（biotin）由咪唑酮环和噻吩环组成，与亲和素结合的主要是咪唑酮环，而噻吩环侧链末端的羧基则与rgd肽上的氨基结合。

4、进一步，所述亲和素磁珠的粒径为0.5-50.0μm。所述粒径大小由流式细胞仪的性能决定，本发明所述的粒径大小可以满足绝大部分流式细胞仪检测的要求。

5、进一步，所述rgd肽包括如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq idno.4、seq id no.5或seq id no.6所示的全长或片段。具体序列信息如表1所示。

6、表1

7、

8、arg-gly-asp(rgd)序列是广泛存在于许多细胞外基质蛋白的最小活性片段，是黏附蛋白与细胞表面特异受体蛋白相互作用的识别位点。然而天然蛋白的小分子rgd肽段一般半衰期短，生物利用度较低，易酶解，减弱了治疗效果和生物活性，因此现在有很多研究致力于对天然肽进行结构优化改造，包括对肽段上的氨基酸进行替换、将直链的rgd肽修饰为环形的rgd肽等。本发明将rgd肽与生物素-亲和素（bsa）系统进行偶联，借助生物素-亲和素的多级放大效应，可以提高检测的灵敏度和特异性。

9、一种利用磁性微珠来进行血小板交叉配型的方法，包括如下步骤：

10、1）用生物素上噻吩环侧链末端的羧基与rgd肽上的氨基进行缩合反应形成生物素-rgd肽或直接化学合成生物素-rgd肽，然后将亲和素磁珠上活化的色氨酸残基与生物素的咪唑酮环共价结合形成rgd肽-bsa磁珠复合物，其中1个生物素偶联1个rgd肽，所述亲和素磁珠上的每个亲和素可以结合4个生物素-rgd肽；

11、2）将所述rgd肽-bsa磁珠复合物与供者全血在30℃-40℃条件下孵育20-40min，使rgd肽与血小板结合，进一步形成血小板-rgd肽-bsa磁珠复合物以将血小板从供者全血中分离；

12、3）将分离得到的所述血小板-rgd肽-bsa磁珠复合物与受者血浆或血清在30℃-40℃条件下孵育20-40min；

13、4）将用荧光酶、荧光素或吖啶酯标记的抗人igg/igm/iga单克隆抗体或多克隆抗体与步骤3）得到的复合物再孵育20-40min；

14、5）用流式细胞仪或化学发光仪检测步骤4）得到的复合物的荧光信号（使用荧光标记的抗人igg/igm/iga单/多克隆抗体可以确定抗体是否已结合以及抗体与相应细胞的结合程度）；

15、6）数据处理：将用磁珠复合物偶联的的供者血小板与受者血浆或血清进行交叉配型，再与荧光标记的抗体孵育，设置荧光值的平均值+2*标准差为cutoff值，高于所述cutoff值表示交叉配型失败，低于所述cutoff表示交叉配型成功。

16、在本发明的其中一个实施例中，取10份正常人的血小板与10份未怀过孕，未输过血的人的血浆进行交叉配型。用流式细胞仪测荧光值，这100个荧光值的平均值+2*标准差为cutoff值，高于该值表示交叉配型失败，低于该值表示交叉配型成功。

17、进一步，所述步骤2)中rgd肽-bsa磁珠复合物与供者全血的体积比为5-10:2-5。以确保每个磁珠复合物上都结合有足够的血小板。

18、优选地，rgd肽-bsa磁珠复合物与供者全血的体积比为5:2。

19、进一步，所述rgd肽包括如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq idno.4、seq id no.5或seq id no.6所示的全长或片段。

20、进一步，所述步骤1)中的亲和素磁珠粒径为0.5-50.0μm。

21、上述磁性血小板吸附复合物在自动化血小板交叉配型中的应用。

22、进一步，所述磁性血小板吸附复合物用于在磁场作用下从全血样品中分离血小板。

23、进一步，所述磁性血小板吸附复合物偶联的供者血小板与受者血浆或血清进行交叉配型，再与荧光标记的抗体孵育，设置荧光值的平均值+2*标准差为cutoff值，高于所述cutoff值表示交叉配型失败，低于所述cutoff表示交叉配型成功。

24、进一步，所述磁性血小板吸附复合物中的rgd肽用于结合血小板膜糖蛋白。

25、本发明提供的磁性血小板吸附复合物可以特异性地吸附血小板，在磁场的作用下，磁珠血小板复合物被吸附在离心管的管侧壁或者是管底，其余的废液可以被轻松移走，或者直接甩掉。如果不采用磁珠系统，血小板的分离只能利用常规离心以后弃去上清液，底部的沉淀就是血小板，采用这种方法会出现分离不彻底的情况。此外，采用这种传统的分离方法，需要依赖人工操作，不能实现仪器自动化操作。

26、有益技术效果

27、1）本发明合成了一种包含rgd肽与生物素-亲和素（bsa）系统的磁性血小板吸附复合物，该复合物用于从全血中分离血小板，进而用于血小板交叉配型，并且可以实现血小板的自动化分离。

28、2）本发明创新地将bsa系统与磁珠偶联后去吸附血小板，与传统的直接用血小板交叉配型相比，将检测灵敏度提高至8倍以上。并且传统的方法分离和清洗都只能用离心的方法，依赖于实验人员的手动操作，而本发明利用磁珠可以实现仪器自动化操作。