一种龙眼肉的药物制剂的指纹图谱的构建方法及含量测试方法与流程

本发明涉及中药检测领域，具体涉及一种龙眼肉的药物制剂的指纹图谱的构建方法及含量测试方法。

背景技术：

1、龙眼肉配方颗粒是通过对中药龙眼肉进行提取、浓缩、制粒所得。龙眼肉为无患子科植物龙眼dimocarpus longan lour.的假种皮，始载于《神农本草经》。明代李时珍曰：食品以荔枝为贵，而资益则龙眼为良。龙眼肉味甘、性平，无毒。入心、脾二经。不热不寒，和平可贵，其助心生智也。龙眼肉营养丰富，主要化学成分为糖类、核苷类、多肽类等。现代药理学研究表明，龙眼肉具有抗氧化、抗衰老、抗菌、抗肿瘤等药理作用。龙眼肉为药典品种中药，中国药典未对其从成分分析的角度制定其标准。文献也对龙眼肉中化学成分进行阐述，然而，一方面，通过上述单一成分的含量测定或鉴别龙眼肉配方颗粒，不能从整体上检测和控制其质量；另一方面，通过单一成分的含量测定联合其他成分的鉴别龙眼肉配方颗粒，费时、费力，难以广泛地应用于生产实践。

2、而现有技术中，对龙眼肉的质量控制都是针对龙眼肉药材，并非是针对龙眼肉的药物制剂，现有技术中针对龙眼肉药材的构建方法并不能适用于龙眼肉的药物制剂。因此，建立一种能够全面地、快速地检测龙眼肉的药物制剂的方法，对于其全面质量检测和整体质量控制具有重要意义。

技术实现思路

1、因此，本发明的目的在于提供一种龙眼肉的药物制剂的指纹图谱的构建方法及含量测试方法，该方法根据龙眼肉的药物制剂的特点，建立该品种的指纹图谱，实现各特征峰有效分离，提高特征峰的个数，同时缩短检测分析时间，提高分离效果，能够快速、全面地检测龙眼肉的药物制剂。

2、为此，本发明提供了一种龙眼肉的药物制剂的指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：

3、制备供试品溶液；

4、采用高效液相色谱法对供试品溶液进行检测，色谱条件包括，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相a、以含磷酸的水溶液为流动相b，按照如下程序进行梯度洗脱：

5、0-15min，流动相a与流动相b的体积比为0％：100％，

6、15-50min，流动相a与流动相b的体积比为0％：100％→5％：95％，

7、50-60min，流动相a与流动相b的体积比为5％：95％→8％：92％。

8、进一步地，采用规格为250mm×4.6mm，5μm的色谱柱；和/或，所述供试品溶液的进样量为5-20μl；和/或，含磷酸的水溶液中磷酸的体积百分数为0.1-0.3％；和/或，检测波长为260-264nm，柱温为20-35℃，流速为0.5-1.0ml/min。

9、进一步地，柱温为23-27℃。

10、进一步地，流速为0.7-0.9ml/min。

11、进一步地，采用规格为250mm×4.6mm，5μm的岛津gl science inertil ods-3色谱柱。

12、进一步地，所述供试品溶液的制备方法为：称取供试品，加溶剂提取，得到提取液，固液分离，取液体，即为供试品溶液。

13、所述供试品溶液的制备方法还满足如下a-e中的任意一项或者多项：

14、a、供试品的质量与溶剂的体积之比为0.2-1.0：10-50；质量与体积的关系为g/ml；

15、b、提取方式为回流提取或者超声提取；

16、c、提取时间为≥10min，优选为15-60min；

17、d、所述固液分离选自离心或者滤膜过滤；

18、e、溶剂选自水、甲醇和乙醇中的至少一种，优选为水或者甲醇水溶液。

19、进一步地，溶剂选自体积百分数为5-50％的甲醇水溶液。溶剂选自体积百分数为5-30％的甲醇水溶液。

20、示例性地，所述供试品溶液的制备方法为：取供试品，精密加入溶剂，密塞，称定重量，超声处理，取出，放冷，再称定重量，用溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

21、进一步地，所述的构建方法还包括采用尿苷、5-羟甲基糠醛、尿嘧啶、鸟苷中的至少一种为对照品加溶剂制备对照品溶液的步骤，以及按照上述任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照品图谱的步骤；优选的，所述溶剂选自甲醇、乙醇和水中的至少一种；优选的，1ml所述对照品溶液中含各对照品0.005～50μg(例如1～50μg)。

22、进一步地，所述龙眼肉的药物制剂的指纹图谱具有6个共有特征峰，峰2、峰5分别与尿苷、5-羟甲基糠醛对照品参照物峰保留时间相对应，以尿苷对照品参照物峰相对应的峰为s1峰，峰1、峰3～峰4、峰6与s1峰的相对保留时间在规定值的±10％范围之内，峰1、峰3～峰4、峰6的规定值分别为：0.40、1.18、1.56、2.28。

23、本发明还提供了一种龙眼肉的药物制剂的含量测试方法，包括如下步骤：

24、制备供试品溶液；

25、制备尿苷对照品溶液和/或5-羟甲基糠醛对照品溶液；

26、采用高效液相色谱法对供试品溶液以及尿苷对照品溶液和/或5-羟甲基糠醛对照品溶液进行检测，色谱条件包括，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相a、以含磷酸的水溶液为流动相b，按照如下程序进行梯度洗脱：

27、0-15min，流动相a与流动相b的体积比为0％：100％，

28、15-50min，流动相a与流动相b的体积比为0％：100％→5％：95％，

29、50-60min，流动相a与流动相b的体积比为5％：95％→8％：92％。

30、进一步地，采用规格为250mm×4.6mm，5μm的岛津gl science inertil ods-3色谱柱；和/或，所述供试品溶液的进样量为5-20μl；和/或，含磷酸的水溶液中磷酸的体积百分数为0.1-0.3％；和/或，检测波长为260-264nm，柱温为20-35℃，流速为0.5-1.0ml/min。

31、进一步地，所述供试品溶液的制备方法为：称取供试品，加溶剂提取，得到提取液，固液分离，取液体，即为供试品溶液，优选地，所述供试品溶液的制备方法还满足如下a-e中的任意一项或者多项：

32、a、供试品的质量与溶剂的体积之比为0.3-0.7：10-50；质量与体积的关系为g/ml；

33、b、提取方式为回流提取或者超声提取；

34、c、提取时间为≥10min，优选为15-60min；

35、d、所述固液分离选自离心或者滤膜过滤；

36、e、溶剂选自水、甲醇和乙醇中的至少一种，优选为水或者甲醇水溶液。

37、进一步地，尿苷对照品溶液和/或5-羟甲基糠醛对照品溶液制备过程中所采用的溶剂选自甲醇、乙醇和水中的至少一种；和/或，尿苷对照品溶液的浓度为0.03～50μg/ml(例如0.03～5μg/ml)；和/或，5-羟甲基糠醛对照品溶液的浓度为0.005～50μg/ml(例如0.005～1μg/ml)。

38、本发明还提供了一种龙眼肉的药物制剂的质量检测方法，包括将待测龙眼肉产品的指纹图谱与龙眼肉的药物制剂的对照指纹图谱进行比较的步骤和/或采用上述任一所述的龙眼肉的药物制剂的含量测试方法测定待测龙眼肉产品的含量的步骤；所述待测龙眼肉产品的指纹图谱为使用待测龙眼肉产品按照上述任一所述的构建方法构建得到，所述龙眼肉的药物制剂的对照指纹图谱选自如下(1)-(3)中的任意一项：

39、(1)其具有6个共有特征峰，峰2、峰5分别与尿苷、5-羟甲基糠醛对照品参照物峰保留时间相对应，以尿苷对照品参照物峰相对应的峰为s1峰，峰1、峰3～峰4、峰6与s1峰的相对保留时间在规定值的±10％范围之内，峰1、峰3～峰4、峰6的规定值分别为：0.40、1.18、1.56、2.28；

40、(2)使用单批次或者多批次龙眼肉的药物制剂按照上述任一所述的构建方法得到的龙眼肉的药物制剂的指纹图谱；

41、(3)使用多批次龙眼肉的药物制剂按照上述任一所述的构建方法得到的指纹图谱通过平均值或者中位数法制成对照指纹图谱。

42、其中，待测龙眼肉产品为龙眼肉的药物制剂。

43、所述龙眼肉配方颗粒对照指纹图谱的相似度大于0.800。

44、本发明技术方案，具有如下优点：

45、1.本发明提供的龙眼肉的药物制剂的指纹图谱的构建方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相a、以含磷酸的水溶液为流动相b，并采用特定的洗脱程序，在缩短检测时间的同时还明显提高了多种有效成分的分离效果，使得指纹图谱中包含了更多的特征峰，极大丰富了图谱信息，实现了尿苷、5-羟甲基糠醛、尿嘧啶、鸟苷在内的特征峰的有效分离，得到的指纹图谱特征性明显，充分反映龙眼肉的药物制剂的整体性和特征性，而基线平稳，峰形好，为全面检测龙眼肉的药物制剂的质量提供依据。

46、2.本发明提供的龙眼肉的药物制剂的含量测试方法，通过以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇为流动相a、以含磷酸的水溶液为流动相b，并采用特定的洗脱程序，可以同时测定尿苷、5-羟甲基糠醛等成分的含量，各成分分离度好，而且该构建方法的精密度较高、稳定性和重复性较好，因此，能够全面地、快速地检测龙眼肉配方颗粒中有效成分及其含量。

47、3.本发明提供的龙眼肉的药物制剂的指纹图谱的构建方法，可以选择s峰尿苷作为指纹图谱中的内参考峰，并且可以确定龙眼肉配方颗粒的6个共有特征峰，并根据s峰尿苷计算出各个共有特征峰的相对保留时间，有利于龙眼肉配方颗粒的全面质量检测和整体质量控制，从而有助于提高该药物使用的安全性和稳定均一性。

48、4.本发明提供的龙眼肉的药物制剂的指纹图谱的质量检测方法，可以同时构建待测龙眼肉的指纹图谱，并进行含量测定，方法简单，便于对龙眼肉的质量进行全面控制。