一种电化学发光免疫传感器及其制备与应用

本发明涉及分析技术方法，特别是涉及一种电化学发光免疫传感器及其制备与应用。

背景技术：

1、甲胎蛋白(α-fetoprotein，afp)是胚胎发育早期的一种主要血清蛋白，在健康的成人体内，其值通常低于25ng/ml，血清中甲胎蛋白的升高对原发性肝癌诊断具有重要的意义。目前甲胎蛋白的检测方法主要有酶联免疫分析法、放射免疫测定法、间接血酶法和琼脂双扩散法等。这些方法前处理过程耗时长、分析时间长、对设备要求极高、并且需要配备专门的技术人员，最关键的是这些方法通常是使用酶作为信号探针，但是用酶作标记，制备过程复杂、价格昂贵，并且酶容易失活导致不稳定。因此，研究一种用于检测afp的新方法或新装置成为了亟待解决的技术问题。

2、电化学发光(ecl)传感器是通过ecl活性发光体与目标分析物发生反应，将目标分析物的浓度转换为光电信号，从而达到分析、检测目的的一种分析装置。ecl生化免疫传感器集合了生物识别专一性、ecl发光体的生物兼容性及光电信号检测放大作用的优势，具有灵敏度高、选择性好、易于微型化和自动化的特点，在实现微型便携式终端检测设备普及的大健康时代将发挥重要作用。近年来，ecl生化免疫传感的研究工作取得了巨大的进展，其种类和性能也得到了很大的发展，可实现皮摩尔到飞摩尔量级以及单分子/单细胞水平的分析。若是能将ecl技术用于afp的检测，开发一种用于检测afp的电化学发光传感器，将对afp的检测起到重要意义。

3、发光体是ecl传感器的核心部件之一，其发光效率和波段直接决定了ecl传感器的灵敏度、选择性和可靠性等传感器性能。目前基于半导体(cdte、cdse)量子点为标记物的光强型ecl免疫检测方法已有报道，但基于重金属(如铅、镉和汞)的纳米材料被认为具有急性和慢性毒性，这限制了它们的生物应用。为了解决这个问题，迫切需要开发对生物组织具有低毒性或无毒性的新型纳米材料。

4、碳点(caborn dots,简称cds)作为一种2004年首次发现的新型荧光碳基纳米材料，由于其良好的生物相容性、化学稳定性和优异的光致发光性能且生产成本低廉等优点，在光电器件、生物成像、催化以及发光二极管(led)等领域引起了科研工作者的深入研究。

5、与传统的碳化cds不同，聚合物碳纳米点(pcnds)作为一种碳化聚合物点(cpds)，通常是通过聚合物团簇的碳化产生，具有聚合物/碳杂化结构，其表面含有丰富的官能团/聚合物链和尺寸小于20nm的碳核。pcnds不仅具有传统碳化cds突出的光学性能和生物相容性，而且继承了聚合物的性能。由于聚合物/碳杂化结构和特殊的pl机理，它们具有高氧/氮含量、优异的水溶性和优异的光致发光量子产率(plqy)等独特特性。

6、若是能将pcnds与ecl传感器以及afp的检测相结合，开发一种基于pcnds的用于检测afp的电化学发光传感器，将具有十分广阔的应用前景。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种电化学发光免疫传感器及其制备与应用，以解决上述现有技术存在的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明的技术方案之一：一种电化学发光(ecl)免疫传感器，所述电化学发光免疫传感器的工作电极为依次在玻碳电极(gce)表面修饰金纳米粒子(aunps)、甲胎蛋白一级抗体(ab1)、牛血清白蛋白(bsa)、甲胎蛋白(afp)、pcnds-ab2复合物得到的gce|aunps|ab1|bsa|afp|pcnds-ab2。

4、进一步地，所述pcnds-ab2复合物为pcnds标记的甲胎蛋白二级抗体，所述pcnds以色氨酸和精氨酸为前体，采用一锅水热法合成。

5、本发明的技术方案之二：一种利用上述电化学发光免疫传感器检测甲胎蛋白的方法，包括以下步骤：

6、(1)制备pcnds：将色氨酸和精氨酸溶解在水中，得到氨基酸混合溶液，将所述氨基酸混合溶液加热反应，反应结束后冷却，过滤，透析，冷冻干燥，得到所述pcnds；

7、(2)制备pcnds-ab2复合物：将pcnds加入到水中，搅拌，得到pcnds水溶液，将所述pcnds水溶液与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)溶液以及n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)溶液混合，超声分散，离心，得到沉淀；将所述沉淀分散到pbs溶液中，然后加入甲胎蛋白二级抗体溶液，搅拌，再加入牛血清白蛋白溶液，搅拌，离心，得到所述pcnds-ab2复合物；将所述pcnds-ab2复合物分散到pbs溶液中，得到pcnds-ab2复合物溶液；

8、edc和nhs的作用是活化pcnds，使pcnds表面上的羧基官能团具有更高的反应活性，从而使其与ab2进行共价偶联反应，从而制备pcnds-ab2复合材料；

9、(3)构建电化学发光免疫传感器：

10、(a)以玻碳电极作为基底，通过电镀反应在玻碳电极表面沉积金纳米粒子，得到金纳米粒子修饰的工作电极gce|aunps；

11、(b)将甲胎蛋白一级抗体滴加到gce|aunps表面，孵育，得到甲胎蛋白一级抗体修饰的工作电极gce|aunps|ab1；所述孵育的条件为在4℃下孵育12h；

12、(c)将牛血清白蛋白溶液滴加到gce|aunps|ab1表面，孵育，得到牛血清白蛋白修饰的工作电极gce|aunps|ab1|bsa；所述孵育的条件为在37℃下孵育1h；

13、(d)分别将不同浓度的甲胎蛋白标准溶液滴加到gce|aunps|ab1|bsa表面，孵育，得到不同浓度甲胎蛋白修饰的工作电极gce|aunps|ab1|bsa|afp；所述孵育的条件为在37℃下孵育2h；

14、(e)将pcnds-ab2复合物溶液滴加到不同浓度甲胎蛋白修饰的工作电极gce|aunps|ab1|bsa|afp表面，孵育，得到pcnds-ab2复合物修饰的含有不同浓度甲胎蛋白标准溶液的工作电极gce|aunps|ab1|bsa|afp|pcnds-ab2；所述孵育的条件为在37℃下孵育2h；

15、(4)绘制工作曲线：

16、将工作电极gce|aunps|ab1|bsa|afp|pcnds-ab2与参比电极和对电极构成三电极系统，以含有k2s2o8的pbs溶液为电解质溶液，分别对步骤(e)中得到的含有不同浓度甲胎蛋白标准溶液的工作电极gce|aunps|ab1|bsa|afp|pcnds-ab2进行ecl检测，记录ecl信号强度，ecl信号强度与甲胎蛋白标准溶液浓度的对数呈线性关系，以甲胎蛋白标准溶液浓度的对数为横坐标，ecl信号强度为纵坐标绘制工作曲线；

17、(5)甲胎蛋白的检测：将待测甲胎蛋白样品溶液代替步骤(d)中的甲胎蛋白标准溶液制备工作电极gce|aunps|ab1|bsa|afp|pcnds-ab2，按照步骤(4)进行检测，根据ecl信号强度和工作曲线得到待测甲胎蛋白的含量。

18、进一步地，步骤(1)中所述色氨酸和精氨酸的摩尔比为1:1，所述氨基酸混合溶液中色氨酸的浓度为0.05m；所述加热反应的温度为200℃，时间为8h。

19、进一步地，配制氨基酸混合溶液时，先将称量的色氨酸和精氨酸溶解在一部分水中，用1m hcl调节ph值至2，再添加水定容至要求浓度。调节ph后的溶液是强酸溶液，再加水后对ph的影响较小。先调节好ph值再定容是为了确保生成的pcnds具有良好的形貌和性质，并且确保最终得到的pcnds具有一致的性质，是制备过程中的重要步骤。

20、进一步地，所述过滤的具体操作为：使用孔径为0.22μm的针头过滤器过滤，所述透析的具体操作为：使用截止分子量为500～1000da的纤维素酯透析袋在超纯水中透析10h，每2h换一次水。

21、进一步地，步骤(2)中所述pcnds水溶液的浓度为10mg/ml，所述edc溶液的浓度为10mg/ml，所述nhs溶液的浓度为10mg/ml，按体积比计，pcnds水溶液：edc溶液：nhs溶液＝5:1:1。

22、进一步地，步骤(2)中将沉淀分散到0.1m pbs溶液中时，0.1m pbs溶液与制备沉淀时使用的pcnds水溶液的体积比为2:5，将沉淀分散到0.1m pbs溶液后加入的甲胎蛋白(afp)二级抗体(ab2)的浓度为1mg/ml，加入量为0.1m pbs溶液的5vol.％，加入的bsa溶液的浓度为3wt.％，加入量为0.1m pbs溶液的5vol.％；将pcnds-ab2复合物分散到0.1m pbs溶液中时，0.1m pbs溶液与一开始制备沉淀时使用的pcnds水溶液的体积比为1:5。

23、进一步地，步骤(a)中所述电镀反应的电解液为含haucl4和kcl的pbs溶液，所述电镀反应的条件为：以-0.2v的工作电压反应200s。

24、进一步地，所述含haucl4和kcl的pbs溶液中haucl4的浓度为6mm，kcl的浓度为0.1m，pbs的浓度为0.1m。

25、进一步地，步骤(b)中所述甲胎蛋白一级抗体的浓度为18μg/ml，滴加量为10μl；步骤(c)中所述血清白蛋白溶液的浓度为3wt.％，滴加量为10μl；步骤(e)中所述pcnds-ab2复合物溶液的滴加量为10μl。

26、进一步地，步骤(d)中所述不同浓度的甲胎蛋白标准溶液为浓度分别为0.1、10.0、50.0、100、200、300和400ng/ml的甲胎蛋白标准溶液，甲胎蛋白标准溶液的滴加量为10μl。

27、进一步地，步骤(4)中所述含有k2s2o8的pbs溶液中k2s2o8的浓度为80mm，pbs的浓度为0.1m。

28、进一步地，所述玻碳电极(gce)在使用前依次使用粒径为1μm、0.3μm和0.05μm的al2o3打磨粉抛光，使其表面呈现光滑的镜面状，用0.1mk3[fe(cn)6]/0.2m kno3溶液测试电极，抛光处理直到[fe(cn)6]3+/[fe(cn)6]4+的阴极峰和相应阳极峰之间的电位差小于70mv。

29、本发明公开了以下技术效果：

30、(1)本发明以pcnds为ecl探针，afp为模型蛋白，构建了三明治型ecl免疫传感器。在没有任何信号放大策略的协助下，所构建的ecl免疫传感器实现了对癌症标志物afp的灵敏检测，线性范围在0.1～400ng/ml，检出限为0.05ng/ml；同时该ecl免疫传感器在人体血清实际样品的检测中表现出满意的结果，回收率为100.49～102.24％。

31、(2)本发明以色氨酸和精氨酸为前体，采用简便的一锅水热法合成了一种水溶性良好的具有高荧光量子产率，高ecl效率的蓝色荧光纳米材料—pcnds。以该pcnds作为ecl探针构建ecl免疫传感器，ecl信号强，ecl效率高，制备得到的传感器灵敏度高，稳定性好。