一种偶联物的制备方法与流程

本技术涉及生物检测领域，特别是涉及一种突变的酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶(简称g6pdh)及其在皮质醇检测试剂盒中的应用。

背景技术：

1、半抗原，某些小分子物质(分子量小于4000da)，其单独不能诱导免疫应答，即不具备免疫原性，但当其与大分子蛋白质或非抗原性的多聚赖氨酸等载体交联或结合后可获得免疫原性，诱导免疫应答。这些小分子物质可与应答效应产物结合，具备抗原性，它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。

2、半抗原能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应，又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖、类脂、激素、小分子药物都属于半抗原。如果用化学方法把半抗原与某种蛋白分子(载体)结合，会获得新的免疫原性，并能刺激动物产生相应的抗体。半抗原一旦与蛋白结合，就构成该蛋白质的一个抗原簇。一些比一般半抗原分子量小，但有特异结构的化学活性基团物质(如青霉素、磺胺剂等)，称为简单半抗原。

3、小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，多采用竞争模式。原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，显色愈浅。小分子激素、药物等elisa测定多用此法。

4、皮质醇(cortisol)结构式如下所示：

5、

6、皮质醇，亦称氢化可的松，又称氢皮质素或化合物f(compound f)，是从肾上腺皮质中提取出的是对糖类代谢具有最强作用的肾上腺皮质激素(属于糖皮质激素的一种)。

7、皮质醇是通过肾上腺皮质线粒体中的11β-羟化酶的作用，由11-脱氧皮质醇生成。皮质醇也可通过11-β-羟类固醇脱氢酶(11-β-hydroxysteroid dehydrogenase)的作用变成皮质素。

8、皮质醇在许多重要生理过程的调节中发挥着重要作用，包括能量代谢、维持电解质和血压平衡、免疫调节、应激反应、细胞增殖和分化已经记忆调节和认知功能等等。血液中皮质醇主要与皮质类固醇结合球蛋白和白蛋白结合，游离的皮质醇只占3-5％，且皮质醇浓度水平每天呈现周期性变化，前半夜达到最低，并在凌晨达到峰值。

9、血液中测量皮质醇主要用于库欣综合征导致的皮质醇分泌过多和艾迪生病导致的皮质醇缺乏等人类疾病，以及治疗监测(地塞米松抑制疗法和激素替代疗法)。

10、目前已知的皮质醇检测方法主要有：酶联免疫吸附法、化学发光免疫分析法、高效液相色谱法、气液色谱法、气相色谱法和质谱联用等。但这些检测方法均存在较多的缺陷，如化学发光尽管灵敏度较好，但需要配套的专用设备，投入使用成本较高不利于推广。在临床检测诊断过程中，以均相酶免疫法(emit)和胶乳增强免疫比浊法检测为主。

11、均相酶免疫测定的原理：在液体均相反应体系中，酶标记抗原(如g6pdh-皮质醇)与非标记抗原(皮质醇)，竞争与定量的抗体(皮质醇抗体)进行结合，当抗体与非标记抗原结合越多，酶标记抗原释放的活性就越多，酶催化底物nad+生成nadh就越多，在340nm波长下检测nadh的吸光度变化，即可推算出液体中皮质醇的含量。

12、现有的均相酶免疫测定法、胶乳凝集比浊法常常因制备工艺复杂、批间差大，应用受到一定限制。

13、现有技术中描述了一种皮质醇衍生物-g6pdh偶联物及其制备方法：

14、1)将g6pdh室温溶解于含有tris、mgcl2和nacl的溶液中(ph＝9.0)；

15、2)加入nadh、葡萄糖6磷酸以及卡必醇；

16、3)再逐滴加入二甲基亚砜；

17、4)在无水状态下称取皮质醇衍生物，溶解于dmf中；使溶液温度降到-2至-8℃；加入三丁胺；

18、5)加入氯甲酸异丁酯，-2至-8℃搅拌30分钟；

19、6)将上述激活的皮质醇衍生物溶液逐滴加入到溶解的g6pdh溶液中，2至8℃搅拌过夜；

20、7)通过层析柱纯化步骤6)所得溶液，获得的最终产物为g6pdh-皮质醇衍生物的偶联物(例如，但不限于cn105131105a中所述方法)。

21、然而，现有技术的方法依赖于对小分子药物自身所带反应基团进行的激活，之后再与酶进行反应。这样的策略难以保证小分子药物和酶之间的定向1：1反应，而导致批间差异大。

技术实现思路

1、鉴于本领域的需求，本技术提供了一种新型的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体、及其在制备皮质醇检测试剂盒中的用途。

2、根据一些实施方案，提供了一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体。区别于已有发表的专利us006090567a(homogeneous immunoassays using mutant glucose-6-phosphatedehydrogenases)的6磷酸葡萄糖脱氢酶的突变体，本技术的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，其包含选自以下的突变：d306c、g426c、d375c。

3、根据一些实施方案，提供了一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体是选自以下的序列所示：seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4。

4、根据一些实施方案，提供了一种多核苷酸，其编码本技术的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体。

5、根据一些实施方案，提供了一种表达载体，其包含本技术的多核苷酸。

6、根据一些实施方案，提供了一种宿主细胞，其包含本技术的表达载体。宿主细胞可以是原核(如细菌)或真核(如酵母)。

7、根据一些实施方案，提供了一种偶联物，其是本技术的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与半抗原按照摩尔比1：n偶联而成。

8、在一些实施方案中，n是1至50，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50。

9、在一些具体的实施方案中，本技术的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与半抗原按照摩尔比优选为1：1。

10、在一些具体的实施方案中，半抗原的分子量为100da至4000da，例如：100、150、200、250、300、350、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、520、550、570、600、620、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000。

11、根据本技术，技术人员将理解，“半抗原”还包含其衍生物的形式。为了便于和6-磷酸葡萄糖脱氢酶进行偶联，对于那些自身不带有偶联基团(例如，与巯基反应的基团)的半抗原(例如皮质醇)，可以经改造而带有接头，以便和巯基共价结合。因此，在本技术中，半抗原衍生物是指，经改造而带有巯基反应基团的半抗原。

12、半抗原选自：小分子药物(如抗生素、精神药物)、激素、代谢物、糖、脂质、氨基酸。

13、半抗原例如但不限于：茶碱、苯妥英、维生素d、25羟维生素d、1，25双羟维生素d、叶酸、强心甙(包括洋地黄毒苷)、酶酚酸、雷帕明、环胞菌素a、乙胺碘复酮、甲胺喋呤、他克莫司、血清氨基酸、胆汁酸、甘胆酸、苯丙氨酸、乙醇、尿尼柯丁代谢产物柯替宁、尿吗啡、尿单羟酚衍生物、神经肽酪氨酸、血浆甘丙素、多胺、组织胺、促甲状腺激素、泌乳素、胎盘泌乳素、生长激素、促卵泡刺激素、促黄体生成素、促肾上腺皮质激素、抗利尿激素、降钙素、降钙素原、甲状旁腺激素、甲状腺素、三碘甲状原氨酸、反三碘甲状原氨酸、游离甲状腺素、游离三碘甲状原氨酸、皮质醇、尿17-羟皮质类固醇、尿17-酮类固醇、脱氢表雄酮及硫酸酯、醛固酮、尿香草苦杏仁酸、血浆肾素、血管紧张素、促红细胞生成素、睾酮、双氢睾酮、雄烯二酮、17α羟孕酮、雌酮、雌三醇、雌二醇、孕酮、人绒毛膜促性腺激素、胰岛素、胰岛素原、c肽、胃泌素、血浆前列腺素、血浆6-酮前列腺素f1α、前列环素、肾上腺素、儿茶酚胺、去甲肾上腺素、胆囊收缩素、纳素、环磷酸腺苷、环磷酸鸟苷、血管活性肽、生长抑素、促胰液素、p-物质、神经降压素、血栓素a2、血栓素b2、5羟色胺、神经肽y、骨钙素。

14、在具体的实施方案中，半抗原是皮质醇或其衍生物。

15、在具体的实施方案中，半抗原是皮质醇衍生物，其带有巯基反应基团，例如来酰亚胺、溴乙酰基、乙烯基砜或氮丙啶。

16、在具体的实施方案中，半抗原是皮质醇衍生物，如式i所示：

17、

18、在一些实施方案中，m为0至20的整数，优选1至10的整数，优选1至6的整数，例如1、2、3、4、5、6。

19、在一些实施方案中，x是马来酰亚胺、溴乙酰基、乙烯基砜或氮丙啶。

20、技术人员能够理解，x功能在于和6-磷酸葡萄糖的巯基进行反应。马来酰亚胺、溴乙酰基、乙烯基砜、氮丙啶和巯基的共价结合是可以预期的。尽管实施例中，采用具体的特定基团，但不意图限制于此。

21、在一些具体的实施方案中，所述皮质醇衍生物，其具有选自下式的结构：

22、

23、m为0至20的整数，优选1至10的整数，优选1至6的整数。

24、在一些具体的实施方案中，所述皮质醇衍生物，其具有选自下式的结构：

25、

26、

27、根据一些实施方案，提供了一种试剂，其包含本技术的偶联物。

28、根据一些实施方案，提供了本技术的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体在制备皮质醇检测试剂中的用途。

29、根据一些实施方案，提供了本技术的偶联物在制备皮质醇检测试剂中的用途。

30、在具体的实施方案中，所述的检测试剂选自：酶联免疫法检测试剂、化学发光免疫法检测试剂、均相酶免疫法检测试剂、胶乳增强免疫比浊法检测试剂。

31、在具体的实施方案中，所述的检测试剂优选是基于竞争法检测的试剂。

32、根据一些实施方案，提供了本技术的偶联物在制备皮质醇检测装置中的用途。

33、在具体的实施方案中，所述的检测装置可以制备成孔板(例如96-孔板)的形式，比如板上包被根据本技术的试剂。

34、在具体的实施方案中，所述的检测装置可以制备成颗粒(例如胶乳、磁珠)的形式，比如颗粒上包被根据本技术的试剂。

35、根据一些实施方案，提供了一种皮质醇检测试剂盒，其包含：

36、-第一试剂，所述第一试剂包含底物、缓冲液和皮质醇抗体；所述底物是6-磷酸葡萄糖脱氢酶的底物；

37、-第二试剂，所述第二试剂包含本技术的偶联物和缓冲液；

38、-任选地，校准品，所述校准品包含10mm至500mm缓冲液、0ng/ml至800ng/ml皮质醇；以及

39、-任选地，质控品，所述质控品包含10mm至500mm缓冲液、100ng/ml至500ng/ml皮质醇。

40、根据一个实施方案，提供了一种皮质醇检测试剂盒，其包含：

41、第一试剂，其包含：

42、10mm至500mm缓冲液、

43、5mm至50mm底物、

44、10ng/ml至10μg/ml的皮质醇抗体、

45、0.1g/l至5g/l稳定剂、

46、0.1g/l至5g/l表面活性剂、

47、0.1g/l至5g/l防腐剂；

48、第二试剂，其包含：

49、10mm至500mm缓冲液、

50、0.01μg/ml至10μg/ml根据本技术的偶联物、

51、0.1g/l至5g/l稳定剂、

52、0.1g/l至5g/l表面活性剂、

53、0.1g/l至5g/l防腐剂。

54、在一些实施方案中，所述缓冲液选自以下的一种或组合：氨基丁三醇缓冲液、磷酸盐缓冲液、tris-hcl缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、巴比妥缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、三羟甲基甲烷缓冲液；优选，磷酸盐缓冲液；所述缓冲液的浓度为10mmol/l至500mmol/l，优选100mm；所述缓冲液的ph为7至8。

55、在一些实施方案中，所述稳定剂选自以下的一种或组合：牛血清白蛋白、海藻糖、甘油、蔗糖、甘露醇、甘氨酸、精氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000；优选牛血清白蛋白。

56、在一些实施方案中，所述表面活性剂选自以下的一种或组合：brij35、triton x-100、triton x-405、tween20、tween30、tween80、椰子油脂肪酸二乙醇酰胺、aeo7，优选tween20。

57、在一些实施方案中，所述的防腐剂选自以下的一种或组合：叠氮化物、mit、生物防腐剂pc(如pc-300)、硫柳汞；所述叠氮化物选自：叠氮钠、叠氮锂。

58、在一些实施方案中，所述底物包含：6-磷酸葡糖糖、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。

59、在一些具体的实施方案中，所述皮质醇抗体源自：小鼠、大鼠、猫、犬、灵长类、牛、马、羊、骆驼科、禽、人。

60、在一些具体的实施方案中，所述皮质醇抗体选自：单抗、多抗、重组抗体、嵌合抗体、抗原结合片段。

61、根据一些实施方案，提供了一种偶联物的制备方法，包括步骤：

62、1)提供根据本技术的皮质醇衍生物，尤其是在非质子性溶剂(例如但不限于乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜)中提供根据本技术的皮质醇衍生物；

63、2)提供6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，优选在缓冲液(其提供反应环境，例如但不限于pbs、tris、taps、tapso，所述缓冲液ph为6.0至8.0)中提供6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体；

64、3)在18℃至28℃，将所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体和所述皮质醇衍生物按照摩尔比1：n接触1小时至4小时(优选2小时至3小时)使得所述皮质醇衍生物和所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体发生偶联，得到所述种偶联物；

65、4)根据需要，任选对所述种偶联物进行纯化，例如脱盐处理等。

66、在一些实施方案中，反应体系中酶和半抗原的接触摩尔比1：n，其中n是1至50，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50。

67、在另一些实施方案中，反应体系中酶和半抗原的接触摩尔比1：n，其中n是0.01至1，例如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9。

68、在一些具体的实施方案中，步骤1)和2)可互换或并行。

69、在一些具体的实施方案中，在偶联之前，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶包含一个或多个游离的巯基，从而允许和皮质醇实现定向反应。

70、野生型6-磷酸葡萄糖脱氢酶不含游离的巯基，因此在一些具体的实施方案中，6-磷酸葡萄糖脱氢酶是经过基因工程改造的，使其在特定位点(306、375或426位)上的氨基酸突变为半胱氨酸，从而带有一个游离巯基。