空白血液基质、干血片及其制备和在检测靶标中的应用的制作方法

本发明涉及生物，具体涉及一种空白血液基质。

背景技术：

1、液相色谱-串联质谱法具有特异性强、灵敏度高、线性范围宽和一次进样可检测多种化合物等突出优势，作为一种重要的检测技术被广泛应用与临床检测和药物研发。干血片(dried blood spot，dbs)是一种将采集简单、运输便捷和可长期储存的血液样本采集方法。对于婴幼儿、不能大量和频繁采血的患者，液相色谱-串联质谱法对干血片的临床检测有重大优势，但是液相串联质谱技术检测对干血片的研究并不如对血清、血浆、尿液等基质的多，究其原因，除了高灵敏度仪器还需更新迭代外，不存在人源性空白血液基质，也是很大的挑战。

2、人源性血液与待测生物具有相同的生物特性，可做人疾病检测试剂盒和检测方法中的校准品和质控品的理想基质。但是人源性空白血液存在一定的限制性，一方面，人血的采集在世界范围内都严格受控，且运输和储存成本高昂。同时，我国法律严格禁止人血液(指用于临床的全血、成分血和用于血液制品生产的原料血浆)买卖；另一方面，对于外源性物质的检测，可以使用正常人的样本作为空白基质，但是对于内源性物质的检测，就很难获得人源性空白基质用于标准曲线和质控的配制。现有临床检测方法和体外诊断试剂盒校准品和质控品基质多采用对人全血和动物全血进行处理，合成血液替代基质，该方法可有效去除血浆中的内源性物质，存在于血红细胞中的内源性物质还是不能去除，较高的基底值用做校准品和质控品，就不能在临床需要覆盖的检测浓度范围内得到准确的测定结果。空白血液基质的难获得一定程度上限制了干血片临床检测方法的开发和体外诊断试剂盒的生产。

3、因此，寻找具有相似生物特性且有极低内源物基底的可替代人全血的空白血液基质具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有人全血的空白血液基质存在较大基质效应和内源性物质不可消除的基底，以及靶标测试准确性不理想的问题，本发明第一目的在于，提供一种能够有效模拟人全血并具有超低基质效应全复配型空白血液基质。

2、本发明第二目的在于，提供包含所述空白血液基质的干血片。

3、本发明第三目的在于，提供所述的空白血液基质或干血片在制备检测靶标的体外诊断试剂盒中的应用。

4、为了更好地模拟全血特点，行业内常通过吸附、离心等手段对全血进行分离的方式获得基质，现有方法得到的基质仍存在较大的基质效应和内源性物质不可消除的基底，靶标测试的准确性、回收率并不理想。针对该问题，本发明跳脱出行业内认知，在行业内首次提供了一种全配制获得空白基质的思路，然而，研究发现，为了实现该全新的思路，需要解决难于有效模拟全血特点以及难于实现有效测定等技术难题，针对本发明思路面临的技术难题，本发明经过深入研究，提供以下解决方案：

5、一种空白血液基质，为包含血红蛋白、血清蛋白、ph调节剂、稳定剂、表面活性剂、磷酸盐缓冲液的混合溶液；

6、其中，血红蛋白的浓度为20％-60％(m/v)，血清蛋白的浓度为≤20％(m/v)、稳定剂的浓度≤10％(m/v)、表面活性剂的浓度≤0.5％(m/v)、ph调节剂浓度≤0.5％(m/v)。

7、本发明提供了一种全复配的空白血液基质，其基于成分以及比例的联合控制，能够实现协同，能够很好地模拟全血，且其基本不含氨基酸、肉碱、有机酸、激素、脂肪酸、维生素、神经递质或药物等内源性靶标物质，使其兼顾了优异的全血模拟以及低基质效应特点。

8、本发明中，所述的血红蛋白为牛血红蛋白或猪血红蛋白或人血红蛋白中的至少一种。

9、本发明中，所述的ph调节剂包括酸性物质和/或碱性物质；

10、所述的酸性物质包括甲酸、乙酸、氟化铵、盐酸中的至少一种；

11、所述的碱性物质包括氨水、氢氧化钠中的至少一种。

12、本发明中，所述的稳定剂为海藻糖、甘露醇中的至少一种。

13、在所述方法中，所述稳定剂是基质有保护作用的成分；

14、本发明中，所述的表面活性剂为吐温-20、吐温-80中的至少一种。

15、在所述方法中，所述表面活性剂有增溶扩散的作用；

16、本发明中，所述的磷酸盐缓冲液为pbs缓冲液，进一步可以为100mm磷酸钠；9.0％nacl；ph 6.8±0.1(25℃)的pbs缓冲液。

17、本发明中，可根据需要，进一步通过超纯水调控各成分的浓度。

18、本发明所述的空白血液基质为模拟全血的空白血液基质。

19、优选地，所述的血红蛋白为牛血红蛋白或猪血红蛋白的至少一种，牛血红蛋白或猪血红蛋白更易获得。

20、优选地，所述的空白血液基质中，所述血红蛋白的浓度为30％-50％(m/v)；

21、所述血清蛋白的浓度为2％-10％(m/v)；

22、所述ph调节剂的浓度为0.1～0.5％(m/v)；

23、所述稳定剂的浓度为1％-10％(m/v)；

24、所述表面活性剂的浓度为0.1％-0.5％(v/v)；

25、溶剂为pbs缓冲溶液和水的混合溶剂；

26、更进一步优选，空白血液基中，所述血红蛋白的浓度为40％-45％(m/v)；

27、所述血清蛋白的浓度为3％-5％(m/v)；

28、所述ph调节剂的浓度为0.3～0.5％(m/v)；

29、所述稳定剂的浓度为4％-6％(m/v)；

30、所述表面活性剂的浓度为0.3％-0.5％(v/v)；

31、溶剂为体积比为5～15:85～95的pbs缓冲溶液和水的混合溶剂。

32、本发明还提供了一种所述的空白血液基质的制备方法，将各成分混合均匀即得。

33、例如，本发明典型的制备过程为：获得血红蛋白、血清蛋白，磷酸盐缓冲溶液和酸性/碱性物质，取血红蛋白和血清蛋白，加入酸性/碱性物质和磷酸盐缓冲溶液及超纯水，及加入海藻糖和吐温-20，使用混匀器充分混匀，即得用于空白基质的空白血液基质。

34、本发明还提供了一种空白血液干血片，其包括载体及其负载的本发明所述的空白血液基质的干物质。

35、本发明中，所述的载体为纸基材料，进一步为滤纸，进一步可以为903#滤纸片。

36、本发明中，所述的空白血液干血片的制备方法例如为：将空白血液基质滴加在载体中，随后经干燥处理，即得。例如，使用移液器吸取上一步骤中的空白血液60μl，滴加于国际903#滤纸片上，避光干燥，得到干血片空白基质。

37、本发明还提供了所述的空白血液基质或所述的空白血液干血片在制备用于测试靶标的测试试剂盒中的应用。

38、本发明中，可将所述的空白血液基质或所述的空白血液干血片用于靶标特别是全血样品中的靶标的测定。例如，可将所述的空白血液基质或所述的空白血液干血片用于制备测试靶标的标准样品或者质控品；进而用于靶标物质的测定。

39、本发明中，所述靶标例如为氨基酸、肉碱、有机酸、激素、脂肪酸、维生素、神经递质或药物。

40、所述氨基酸具体为赖氨酸(lys)、组氨酸(his)、精氨酸(arg)、丙氨酸(ala)、谷氨酸(glu)、异亮氨酸(ile)、苯丙氨酸(phe)、丝氨酸(ser)、缬氨酸(val)、苏氨酸(thr)、酪氨酸(tyr)、天冬酰胺(asn)、色氨酸(trp)、谷氨酰胺(gln)、蛋氨酸(met)、天冬氨酸(asp)、甘氨酸(gly)、亮氨酸(leu)、脯氨酸(pro)、半胱氨酸(cys)、磷酸乙醇胺(petn)、γ-氨基丁酸(gaba)、牛磺酸(tau)、β-氨基异丁酸(baib)、乙醇胺(etn)、鸟氨酸(orn)、鹅肌肽(ans)、肌肽(car)、瓜氨酸(cit)、羟脯胺酸(hyp)、1-甲基组氨酸(1mhis)、3-甲基组氨酸(3mhis)、羟基赖氨酸(hylys)、高瓜氨酸(hcit)、同型半胱氨酸(hcy)、α-氨基己二酸(aad)、α-氨基丁酸(abu)、肌氨酸(sar)、磷酸丝氨酸(p-ser)、β丙氨酸(β-ala)、犬尿氨酸(kyn)、精氨基琥珀酸(asa)、胱硫醚(cth)。所述肉碱具体为游离肉碱、乙酰肉碱、丙酰肉碱、丙二酰肉碱/3-羟基-丁酰肉碱、丁酰肉碱、甲基丙二酰肉碱/3-羟基-异戊酰肉碱、异戊酰肉碱、异戊烯酰肉碱、戊二酰肉碱/3-羟基-己酰肉碱、己酰肉碱、已二酰肉碱、辛酰肉碱、辛烯酰肉碱。所述有机酸为2-羟基异戊酸、2-酮异己酸、2-羟基丁酸、3-羟基丁酸、3-羟基异丁酸、2-酮异戊酸、甲基丙二酸、甲基枸橼酸。所述维生素具体为维生素a和维生素e。所述激素具体为脱氢表雄酮硫酸盐、皮质醇和雄烯二酮。所述脂肪酸具体为γ-亚麻酸、亚油酸、油酸、二十碳三烯酸和二十二碳四烯酸。

41、发明的有益效果在于：

42、本发明跳脱出对全血基质纯化的技术教导，首次提出了全配制的空白基质技术思路，并创新地通过所述的成分以及比例的联合控制，协同解决全配制基质所面临的难于有效模拟人血液样品、测试效果不理想等问题。

43、本发明所述的空白基质至少具有以下特点：第一：物料均易获得，性能稳定且成本低廉，可商品化购买；与人血液样品有相似的生物特征；第三，合成空白血液基质相对比于人或者动物血液，更易储存和运输，空白基质血液可-20℃存放2个月以上，所滴制空白干血斑可-20℃存放6个月以上；第四，合成内源性化合物和药物具有极低的基底，对于部分内源性的化合物来说，一般对人或者动物血液离心吸附的方式只能一定程度上降低基底值，并不能完全去除，本方法中合成的空白血液基质基底值远低于对人或者动物血液处理后的基质基底，后者为血液临床检测所常用的空白基质获得方式。

44、血液由血浆和血细胞组成，其中，血细胞约占血液容积的45％。常见空白血液基质的合成中，多对人或动物血液进行净化和部分基质替代处理，其中，血浆多采用活性炭或蒙脱石吸附以去除血浆基底值，血细胞多采用清洗、吸附、冻破等方式去除血细胞中基底值，如上所述，对于内源性化合物，人或者动物血液的处理后重组只会一定程度上降低基底值，依旧在血浆、血细胞中的残留的基底值，用作临床血液检测的校准品会影响临床测定范围的测值的准确性；用作质控品时，较高的参考靶值将无法准确监测方法的准确性。鉴于此，本发明使用pbs、bsa、酸/碱等配制的替代血浆基质，及一定比例的商品化血红蛋白配制了与人血液样品有相似生物特征和极低基底值的空白血液基质。

45、本发明的空白血液基质制备方法可用于现有的氨基酸、肉碱、有机酸、激素、脂肪酸、维生素、神经递质或药物等检测系统、平台、检测装置或试剂盒中空白样品的制备生产与应用。