微流控单面无极压电石英晶体凝血传感器的制作方法

本发明属于生物医学传感检测，具体涉及一种双通道微流控压电石英晶体凝血传感芯片制备方法。

背景技术：

1、凝血功能关乎生命健康，凝血功能的异常会导致血液系统异常，引发血栓，血友病等疾病，引发一系列严重后果。在实际医疗诊断中也需要先对凝血功能进行检测，才能进行准确诊断及采取抗凝治疗、手术等医疗措施。因此凝血功能的快速检测是必要的检测项目，且凝血检测技术及设备需要向着快速、现场的即时检测方向改进。凝血时间最早被确定为凝血功能的检测指标。迄今为止，凝血指标包括凝血时间上的宏观指标及凝血反应相关物质浓度的微观指标，具体来说包括凝血酶原(pt)时间、部分活化凝血活酶(aptt)时间、凝血酶(tt)时间、纤维蛋白原浓度、d-二聚体浓度等。

2、现在凝血时间等凝血指标的测量需要通过医院检验科的大型仪器设备完成，现有技术中主要以光学比浊法、双磁路磁珠法、血栓弹力图法应用最为广泛和成熟。但是这些常规技术的检测过程时间长、操作流程复杂，且易受到血浆颜色、全血自身粘度差异的干扰，只适用于实验室检测，不能满足即时检测(point-of-care testing,poct)的需求。

3、石英晶体微天平(quartz crystal microbalance,qcm)是基于压电效应的分析检测技术，能对ng级的质量变化作出灵敏响应，具有可实时监测、小型化、低成本、高灵敏等特点，被广泛应用于生化领域。sauerbrey首次提出频率变化与质量变化的具体关系：

4、

5、其中δm表示表面质量变化；δf表示引起的频率变化；f0表示压电石英晶体的基频；a表示压电石英晶体的有效压电面积；μq和ρq表示压电石英晶体的剪切模量和密度。此外，各学者不断对qcm的检测内容及项目进行丰富。kanazawa液相模型的提出表明在液体负载下其频率变化与流体的粘度密度密切相关，使得压电石英晶体实现了在液相中的应用：

6、

7、其中ρl及ηl为液体的密度及粘度。

8、此外耗散型石英晶体微天平(qcm-d)的出现，进一步拓宽了压电石英传感器的应用范围，电化学石英晶体微天平(eqcm)则将压电传感器与电化学设备联用，在检测电极表面质量变化的同时，还能同时测定电极表面电流、电量、阻抗等电化学参数的变化情况。

9、压电石英晶体可以对石英晶体表面的质量沉积以及晶体表面液体的粘度密度变化灵敏响应，通过对压电石英晶体表面进行一定的生物学处理可以在液相中实现对表面液相中目标物质的特异性检测，在生化检测方面已经具有广泛应用。因此，研究将压电传感器应用于凝血时间检测将具有广阔的应用前景。在凝血反应过程中，体系粘度会发生显著变化，根据传感器响应变化可以对这一过程进行监测，并转换成临床需要的指标。

10、压电石英晶体传感系统有两种测量方式：主动法(例如谐振电路法)、被动法(例如扫频阻抗测量法)。该方法是把器件作为一个振荡器在振荡电路中稳定振荡，测出其谐振频率，这也是一种比较常用的方法。这种测试方法对于q值比较高、谐振阻抗小的器件是比较实用的，它具有电路简单、准确度高、成本低、仪器便携等优点。但对于高粘度介质振荡能力有限、抗干扰能力差。扫频阻抗测量法可用于高粘性介质的生物传感检测，频谱分析方法是扫描qcm在其谐振频率附近一段频率范围内的频谱(qcm等效阻抗的幅频和相频特性)，通过该频谱可得到qcm的谐振频率、品质因子等参数。

11、现有的qcm传感器研究中，绝大多数使用10mhz甚至更低频率的大尺寸石英晶体(晶体直径14mm,电极直径6mm)。压电石英晶体传感器由石英晶片、金属电极、晶体基座和电极引线构成，引线从支撑石英晶振片和电极的晶体基座上引出，这种结构不适合一次性压电石英晶体微流控芯片的设计。根据弹性波导理论，压电晶体中的厚度剪切波在沿横向传输时，由于压电晶体不同区域的截止频率不一样，绝大多数振动能量都被限制在晶体的电极区域，剪切波的机械位移和电场强度都会在离开电极区域后成指数衰减。然而，最新的研究成果表明液体或被测生物分子膜可以充当晶体的模拟电极，从而在无金属电极覆盖的区域激励厚度剪切波，即剪切波可由金属电极区横向传输至非金属电极区域。由此可以设计出基于非金属模拟电极的压电晶体传感器。实验表明，与标准晶体传感器相比，表面无金属电极压电石英晶体传感器对液体电参数变化的灵敏度可以提高25倍[zhang c,vetelino jf.chemical sensors based on electrically sensitive quartz resonators.sensorsand actuators,2003,b91:320-325.]。现有的压电石英晶体生物传感器大多使用表面镀有金属电极的大型石英晶体，金属电极常采用金、银、钛等金属，其中金电极压电石英晶体的传感能力最佳，但表面镀金一方面会使晶体成本增加；另一方面，镀金会增加晶体厚度，在一定程度上会降低压电石英晶体的灵敏度，因此需要发展无极压电石英晶体传感器。无极裸石英晶体传感器成本大幅降低，可满足一次性使用要求，在发展医学检测芯片具有优势。表面镀有金属电极的石英晶体表面张力不均一，无法开发毛细微流控进样检测芯片。目前表面镀有金属电极的石英晶体生物检测过程多采用滴加进样以及流动注射进样，流动进样会适当加快液体运动速度，增大碰撞几率，有利于对目标物质的准确捕捉与灵敏响应，可以显著降低检测限，实现高灵敏的检测。但流动进样对器械及操作要求高，在检测过程中气泡等微小因素都会对检测信号产生较大扰动，难以满足快速检测的要求。毛细微流控技术因其所需样品量少、检验操作简便等特点在现场快速检测中具有较大优势，在血糖、尿酸检测芯片已成功应用。

技术实现思路

1、扫频激励单面无极压电石英晶体谐振频率检测传感系统

2、图1是本发明采用的压电石英晶体谐振频率检测系统。采用arduino due微机控制直接数字频率合成器(dds)产生特定频率和振幅的正弦波，信号经过放大后激励pqc，产生正弦波和信号源正弦波同时进入幅值检波模块，检波模块获得的信号经过arduino due微机采集后，经过拟合计算出谐振频率。

3、测试系统硬件电路主要由以下四个部分组成:

4、1)arduino单片机模块

5、arduino单片机模块电路主要功能是通过串口控制信号源的频率输出以及对检测模块输出的电压信号进行a/d采集、计算、滤波，最后又通过串口将数据上传到上位机进行下一步的处理。通过arduino单片机设置程序输出不同的电压，从而实现调幅调频。

6、2)信号源电路模块

7、信号源电路模块包括信号发生和调理两大模块。信号发生器以ad9959为核心，以标准的20mhz的晶振作为参考频率源，通过微控制器控制dds输出不同频率的激励信号。因为ad9959输出的信号是微弱的电流信号且含有噪声，所以在激励信号作用于石英晶体前还需要通过电流电压转换电路，低通滤波电路等对dds的输出进行处理。信号调理主要是对参考信号以及通过石英晶体后的测量信号进行进一步的放大和滤波等以满足后期信号检测模块的要求。

8、3)信号检测模块

9、检测模块主要是对参考信号和测量信号的输出幅值、相位进行检测，dds系统的核心是相位累加器，它由一个相位寄存器和一个加法器组成，当时钟脉冲关的上升沿来临时，相位寄存器以固定步长增加，相位寄存器的输出与相位控制字相加，然后输入到波形存储器的地址上。外部指令fsw的改变控制相位增量的大小。一旦给定了相位增量，输出频率就确定了。波形存储器把输入的地址相位信息映射成正弦波幅度的数字量信号，驱动dac输出模拟量。低通滤波器做进一步的平滑处理并滤掉杂散频率得到的所需的信号波形ad9850与ad9851缺少可调节的倍频功能，要产生较高的频率输出，不适合采用高精度恒温晶振作为dds输入源信号，这样输出必然会产生大的误差。由于ad9959输出dac位数较高，可以使输出的频率更光滑，相位噪声更小。考虑到qcm系统的设计需要，选用了adi公司的dds芯片ad9959作为dds信号发生器，可输出200mhz以下的正弦频率信号。本文采用幅度和相位测量芯片对两路输出信号的幅值比和相位差进行测量。

10、4)电源模块

11、电源系统为整个测量系统的提供电源，各个模块所需电源电压不同，需要合理的分配电源以及对电源进行优化设计。

12、实验选用33mhz基频at切型的石英晶体作为传感元件来石英晶体直径8.0±0.1mm，单面钛电极直径3.0±0.1mm。采用pqc扫频-幅值检波系统，获得幅值-频率曲线。研究表明采用高斯拟合时曲线拟合度最优，实验中对同一个pqc进行20组扫频数据，经过高斯拟合后寻找峰值点并计算标准差。对于单面镀钛的33mhz晶体，平均中心频率为32996402.48hz，标准差为0.39045，表明此信号测定技术重复性好。

13、双振幅正弦波激励扫频测定介质粘度变化

14、单一恒定振幅下频率差值δf与溶液粘度均存在相关性，频移值与溶液粘度密度乘积的1/2次方成正比，符合下文公式，这点已经被广泛证实。

15、

16、为了消除测量过程中的不确定因素，扣除测量过程中的背景干扰，本发明采取双振幅激励扫频法，在两个不同振幅(振幅1和振幅2)下所获得的信号差(频移值)作为测量信号，探讨其与粘度变化值相关性。

17、对于压电石英谐振体在溶液中产生的体声波可用公式来描述，

18、其中，f为石英晶体的共振频率，a为qcm的振荡振幅，q是优点因素，p是qcm所消耗的电力，m是qcm石英板的有效质量。

19、在振幅不一样的情况下，波的传递距离不一样，故石英体的谐振频率也发生变化，采用不同振幅下的频差变化值来传感介质粘度-密度的变化在理论上是可行的(dultsev fn,klenerman d,ostanin v p."hearing"bond breakage.measurement of bond ruptureforces using a quartz crystal microbalance[j].langmuir:the acs journal ofsurfaces and colloids,2000,16(11):5036-5040)。

20、本实验体系相对于粘度来说密度变化小，可以认为体系中只存在粘度变化。将溶液在两个不同振幅(a1和a2)下所获得的频移差(δf)作为响应信号，用此响应信号的差值来表征晶体表面溶液粘度密度的变化：

21、δf＝δf介质1a1-a2-δf介质2a1-a2

22、配置质量分数为0.1％、0.5％、1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％一系列质量分数的蔗糖溶液，通过上述扫频技术对同一蔗糖溶液在不同振幅(控制符ccc对应0.5v、fff对应0.8v、3fff对应3.3v正弦波)下的扫频信号进行了采集，并求得相应的谐振频率，将高低振幅下的谐振频率做差得到输出响应信号，将不同粘度溶液的信号差和对应的粘度进行作图，以探究对应浓度下不同振幅的信号响应规律。，两个振幅下的差值信号的变化与蔗糖溶液粘度密度乘积的1/2次方作图，发现差频信号与蔗糖粘度密度乘积开方数的变化在一定范围内呈较好的线性关系，相关系数达到0.9949。将抗凝全血通过等渗溶液进行一系列稀释，将差频信号对全血稀释倍数作图，同样可以发现两者存在良好的线性相关性，相关系数为0.9572。本发明直接获得双振幅下的差频信号作为输出响应信号来检测血凝过程粘度变化。

23、双通道微流控压电石英晶体凝血传感芯片

24、本发明的目的是提供一种一次性双通道微流控压电石英晶体凝血传感芯片，可以实现凝血酶现场快速检测中小型化、一次性的检测需求。

25、双通道微流控压电石英晶体凝血传感芯片的具体结构示意图如图2所示，下面对本发明的结构与组装过程进行详细说明。

26、双通道微流控压电石英晶体凝血传感芯片的具体结构由下至上包括五个重要组件：底层1-1、底层贴片1-2、33mhz单面无极压电石英晶体1-3、中间层2-1，顶层3-1和铜制线圈4-1。

27、底层1-1上有一个6.5mm直径的圆形孔洞，并喷涂有如图所示的铜电极通路1-1-1，底层贴片1-2带有粘性，中间有8mm直径的圆形孔洞，其大小与33mhz单面无极压电石英晶体1-3相同。把底层贴片1-2贴于底层1-1，保证底层贴片1-2的圆形孔洞的圆心与底层1-1圆形孔洞的圆心重合，并将33mhz单面无极压电石英晶体1-3无极面朝上置于底层贴片1-2的圆形孔洞处，保证两者平整无凸起，并且使33mhz单面无极压电石英晶体1-3的电极与底层1-1铜电极通路1-1-1相接触，完成组装后即可得到1-4所示装置。

28、中间层2-1是带有孔洞的长方形薄贴片，有两个2mm直径的圆形孔洞，两个圆形孔洞圆心间距为5mm孔洞下方与细长条形空腔相连，细长条空腔呈“y”字型，一直延伸到中间层2-1最下端，宽度为1mm，将中间层2-1贴在1-4上，保证两者底端对齐，即可得到2-2所示装置。两个圆形孔洞处所裸露出的33mhz单面无极压电石英晶体1-3的两部分无极传感区分别为检测区域2-2-1以及参比区域2-2-2，“y”字型细长条空腔的区域为进样通道2-2-3，最下端的细长条空腔即为进样口2-2-4。

29、在2-2制成后对检测区域2-2-1进行处理，修饰凝血酶适配体及进行封闭，在实验中进行检测；对参比区域2-2-2进行处理，但不修饰凝血酶适配体，使其在实验中作为参比，修饰完毕即可进行接下来的组装。

30、顶层3-1是长方形薄贴片，宽度略小于中间层2-1，表面活性剂改性区3-1-1为进样通道2-2-3所对应的顶层3-1区域，对表面活性剂改性区3-1-1进行表面活性剂改性，并将改性后的表面朝下贴在2-2上，下端对齐得到3-2所示检测芯片，其上端会露出小部分检测区域2-2-1及参比区域2-2-2，所形成的两个孔洞均为透气孔3-2-1。

31、最后将螺旋状铜制线圈4-1贴于顶层3-1上端，即构成了最终的双通道微流控压电石英晶体凝血传感芯片4-2。

32、所述检测片底层1-1、底层贴片1-2、中间层2-1及顶层3-1的加工制造均通过激光雕刻技术实现。

33、所述的33mhz单面无极压电石英晶体1-3通过中间层2-1和顶层3-1两层进行粘粘固定，可以保持晶体的稳定振荡。

34、所述的顶层3-1在检测区域2-2-1、参比区域2-2-2、进样通道2-2-3所对应的区域均为光滑洁净的表面，不带有粘结剂，在组装之前需要对此洁净区域进行表面活性剂改。

35、本发明一次性双通道微流控压电石英晶体凝血传感芯片所采用的传感元件为高频无极压电石英晶体，基频为33mhz，晶体直径为8mm，采用无极传感技术可以避免金属离子对凝血过程等生化反应的影响。传感芯片表面用凝血因子修饰、参比传感芯片用白蛋白修饰。

36、凝血酶原时间(pt)的测定时用含钙组织凝血活酶修饰。

37、活化部分凝血活酶(aptt)的测定时用含钙凝血酶原激酶修饰。

38、凝血酶时间(tt)的测定时用凝血酶修饰。

39、纤维蛋白原(fib)的测定时用凝血酶修饰。

40、测定凝血酶含量时传感器表面修饰过程如下：

41、使用硅烷化固定的方式实现表面修饰，采用带有氨基-nh2的凝血酶适配体探针，通过硅烷化处理、戊二醛活化将适配体固定在石英晶体表面，从而对凝血酶进行免疫学检测，以实现更低的检测限。

42、包括以下步骤：

43、1)对无极压电石英晶体的修饰处理：首先将石英晶片浸泡于一定量aptes溶液中1h，取出后用无水甲苯充分清洗。接下来将硅烷化处理过后的石英晶片置于一定量戊二醛溶液中浸泡30min，去除后用用去离子水冲洗，n2吹干备用。

44、2)传感芯片的初组装：将步骤1)处理后的石英晶片进行组装，组装好双通道微流控压电石英晶体凝血传感芯片的底层和中间层

45、3)凝血酶的修饰：在测试区域滴加适量的凝血酶适配体溶液并孵育3h，在参比区域滴加适量pbs缓冲液并孵育3h，3h后均用去离子水轻轻冲洗，在测试区域与参比区域均滴加适量乙醇胺溶液封闭活性位点。

46、4)传感芯片的终组装：对顶层部分带胶面进行表面活性剂修饰，将顶层与检测通道重合区域均匀涂抹表面活性剂，待干燥后使表面活性剂的表面朝下，与步骤3)处理后的部分检测片装置粘牢，即完成传感芯片的组装。

47、5)凝血酶的检测：将步骤4)中的检测片插入检测系统，并将凝血酶溶液靠近进样口，溶液通过毛细力作用被快速吸入检测通道，迅速充满检测区域和参比区域，系统对检测区域和参比区域的频率信号进行实时测量及记录。随着溶液到达并充满检测区域和参比区域，频率出现变化，δf随着粘度及质量发生改变，将检测区域的频率变化扣除参比区域的频率变化，得到的最终信号值即为扣除了背景信号后表面凝血酶吸附所产生的质量变化信号值。

48、所述步骤1)中aptes溶液的浓度为2％；所述的一定量为2ml；戊二醛溶液浓度为2％；所述的一定量为2ml。

49、所述步骤3)中凝血酶适配体溶液浓度为1μm，所述的适量为10μl；适量pbs缓冲液为10μl、适量乙醇胺溶液为10μl。

50、本发明的技术特征：

51、1)本发明采用高频单面无极压电石英晶体，使用33mhz基频的裸石英晶体(不带电极面)作为传感元件，避免金属电极对压电石英晶体灵敏度的影响，33mhz基频可以极大提高双通道微流控压电石英晶体凝血传感芯片的灵敏度。

52、2)本发明采取双振幅激励扫频法，在两个不同振幅(振幅1和振幅2)下所获得的信号差(频移值)作为传感血液粘度变化的测量信号。

53、3)双通道压电石英晶体传感血凝过程，参比传感器可以减少血样背景、进样过程环境温度等因素影响，提高检测的稳定性。

54、4)本发明采用激光雕刻技术，实现了进样通道、监测区域、参比区域等微型装置的设计与批量加工，可以保证对进样量的精确控制，极大缩小了检测片的尺寸，实现了小型化、易携带。

55、5)本发明采用微流控技术，实现了血浆及血液的自动进样，降低了检测样品的需求量，通过表面活性剂的修饰，实现对进样时间的调整与控制，可以实现现场快速检测。

56、6)本发明结合双通道传感校正技术与适配体探针技术，可以实现对凝血酶的特异性检测，同时参比区域可以避免液体粘弹性及非特异性吸附造成的额外信号值，减少背景干扰，可以建立一个高灵敏度的小型化压电传感芯片。