血小板聚集功能检测试剂、其制备方法及检测方法

本发明涉及凝血检测，特别涉及一种血小板聚集功能检测试剂、其制备方法及检测方法。

背景技术：

1、心脑血管疾病目前已经成为诱发人类死亡和残疾的首要因素。而心脑血管疾病的病理学基础大多是血小板异常激活引起动脉血栓。阿司匹林作为常见的抗血小板药物，应用广泛，是降低心脑血管疾病风险的常见药物。但是由于个体差异及疾病的复杂多样性，部分患者常规剂量的阿司匹林治疗效果不佳，仍然会发生血栓事件，即阿司匹林抵抗。目前，血栓弹力图已成为评价阿司匹林疗效的主要方法。

2、血栓弹力图监测抗血小板药物如阿司匹林疗效是通过血小板聚集功能检测试剂实现的。血小板聚集功能检测试剂包括高岭土激活剂、纤维蛋白激活剂(f)及血小板激活剂花生四烯酸(aa)、二磷酸腺苷(adp)试剂等。当血小板激活剂aa、adp加入时，血小板血栓素a2或adp受体通道被激活导致血小板聚集。由于阿司匹林阻断a2受体通道，所以添加激活剂aa可激活未被阿司匹林抑制的血小板，从而实现对阿司匹林药物的监测。激活剂aa试剂的主要原料花生四烯酸是一种不饱和脂肪酸，在光照和高温环境容易被氧化，甚至在室温下即可通过自由基链式反应氧化，若不采取一定的处理方法将导致激活失败，直接影响测试结果，不能反应真实的用药效果。

3、通常，aa试剂以冻干品形式应用于血小板的激活。有的冻干于西林瓶中，测试前用水复溶使用。也有厂家将其冻干于测试杯中，虽然测试流程更加便捷，但包装成本高，且对于高通量的全自动弹力图设备来言，需要大量的试剂存储空间，所以市面上商品化的血小板激活试剂还是冻干于冻干瓶为主。对于这些冻干试剂而言，通常要求复溶8小时内使用完毕，否则试剂就有活性降低、被氧化等原因导致测试结果不准确的问题。对于复溶超过8小时的试剂只能丢弃处理，造成了极大的浪费。

4、因此，急需灵敏度高、抗氧化性能好、开瓶稳定性好的花生四烯酸试剂来评估服药后患者的血小板功能，从而有效检出血小板药物抵抗的患者，为临床提供参考，同时也能满足全自动血栓弹仪对血小板聚集功能的检测要求。

5、公开专利cn113156144a(郑州普湾)提供一种血小板聚集功能花生四烯酸试剂，包含花生四烯酸钠盐和糖类及聚合物类冻干保护剂。专利cn109884326b(深圳优迪)中提供了一种血小板聚集功能检测试剂盒，包含纤维蛋白激活试剂、内源性凝血激活试剂和血小板诱导剂，各试剂以冻干形式密闭保存于样品杯中。其中对花生四烯酸未提及处理过程，也未包含抗氧化剂成分，仅包含牛血浆白蛋白和常规缓冲液。专利cn104914254a(北京乐普)中提供一种血小板检测方法，将纤维蛋白激活剂和血小板激活剂制成混合试剂，再加入抗氧化剂，分装于样品杯，并将样品杯置于西林瓶中冻干。而市面上常见花生四烯酸微囊过程均是采用喷雾干燥的方法，原料浪费严重，且活性均无法满足激活血小板的要求。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种血小板聚集功能检测试剂、其制备方法及检测方法。

2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：本发明的第一方面，提供一种血小板聚集功能检测试剂，该检测试剂为以花生四烯酸为芯材、以环糊精和阿拉伯树胶为壁材，并添加乳化剂、抗氧化剂、冻干保护剂、防腐剂、缓冲盐和水作为辅助成分制备得到的微囊型花生四烯酸检测试剂，该检测试剂包括按质量百分比计的以下原料组分：

3、花生四烯酸：0.1～1％；β环糊精：0.1-1％；阿拉伯树胶：0.1-1％；乳化剂：0.1-2％；抗氧化剂：0.01-0.1％；冻干保护剂：0.1-10％；防腐剂：0.01-0.1％；其余部分为缓冲盐和水。

4、优选的是，所述乳化剂为酪蛋白、乳清蛋白、单甘油脂肪酸甘油酯、明胶中的任意一种或多种的混合物。

5、优选的是，所述抗氧化剂为vc、ve、硫代硫酸钠、茶多酚、二硫苏糖醇的一种或多种的混合物。

6、优选的是，所述冻干保护剂为peg8000、proneix、bsa、乳糖、海藻糖、蔗糖任一种或多种的混合物。

7、优选的是，所述环糊精为β-环糊精，所述防腐剂为proclin，缓冲盐为磷酸盐缓冲液、tris缓冲液、mes缓冲液的一种，且缓冲盐的浓度为5-50mm；

8、所述乳化剂为酪蛋白，所述抗氧化剂为硫代硫酸钠和二硫苏糖醇的混合物，所述冻干保护剂为proneix和乳糖的混合物，所述缓冲盐为磷酸盐缓冲液。

9、本发明的第二方面，提供一种如上所述的血小板聚集功能检测试剂的制备方法，包括以下步骤：

10、s1、取环糊精、阿拉伯树胶，用缓冲盐溶液充分溶解后冷却至室温，依次加入乳化剂、抗氧化剂、冻干保护剂及防腐剂，搅拌至完全溶解；

11、s2、预乳液制备：于搅拌状态下向步骤s1所得产物中加入花生四烯酸，得到预乳液；

12、s3、乳化：将步骤s1得到的预乳液用均质机充分乳化后分装，预冻；

13、s4、冻干，冻干结束后，真空压塞，得到所述血小板聚集功能检测试剂。优选的是，所述的血小板聚集功能检测试剂的制备方法包括以下步骤：

14、s1、取环糊精、阿拉伯树胶，用60-70℃的缓冲盐溶液充分溶解后冷却至室温，依次加入乳化剂、抗氧化剂、冻干保护剂及防腐剂，磁力搅拌至完全溶解；

15、s2、预乳液制备：在低于16℃环境中、于磁力搅拌状态下向步骤s1所得产物中加入花生四烯酸，得到预乳液；

16、s3、乳化：在低于16℃环境中，将步骤s1得到的预乳液用均质机在8000-16000r/min下乳化5-30min，然后分装，置于-80℃下预冻2-6h；

17、s4、真空度应控制在0.01-1.0mbar下冻干10-24h，冻干结束后，真空压塞，得到所述血小板聚集功能检测试剂。

18、优选的是，所述的血小板聚集功能检测试剂的制备方法包括以下步骤：

19、s1、取0.2wt％的环糊精、0.5％的阿拉伯树胶加入20mm的磷酸盐缓冲液中，70℃下充分溶解后冷却至室温，依次加入1wt％的酪蛋白、0.08wt％的二硫苏糖醇、0.05wt％的硫代硫酸钠、2wt％的proneix、4wt％的乳糖、0.04wt％的proclin，磁力搅拌至完全溶解；

20、s2、预乳液制备：在低于16℃环境中、于磁力搅拌状态下向步骤s1所得产物中加入0.5wt％的花生四烯酸，得到预乳液；

21、s3、乳化：在低于16℃环境中，将步骤s1得到的预乳液用均质机在10000r/min下乳化12min，然后分装，置于-80℃下预冻4h；

22、s4、真空度应控制在0.2mbar下冻干18h，冻干结束后，真空压塞，得到所述血小板聚集功能检测试剂。

23、本发明的第三方面，提供一种血小板聚集功能检测方法，包括以下步骤：

24、1)用规定体积去离子水复溶如上所述的血小板聚集功能检测试剂，静置10-30min，得到检测试剂溶液；

25、2)向测试杯中分别加入纤维蛋白激活剂、步骤1)得到的检测试剂溶液和含阿司匹林的样本，进行血栓弹力图测试，所得血栓弹力图ma值即为花生四烯酸杯血块强度。

26、优选的是，其中，所述的含阿司匹林的样本为服用阿司匹林药物后的人员的血液样本，或者为未服用阿司匹林药物的人员的血液与0.001-0.1mg/ml的阿司匹林混合得到的样本。

27、本发明的有益效果是：

28、本发明以花生四烯酸为芯材，环糊精、阿拉伯胶为壁材，对花生四烯酸进行适度包裹，并选择合适的乳化剂充分乳化均质后加入保护剂、抗氧化剂、防腐剂，采用低温冷冻干燥的方法获得了微囊化花生四烯酸，即血小板聚集功能检测试剂；该方法不仅可使花生四烯酸冻干前后活性不发生变化，而且还能提高花生四烯酸的稳定性。

29、本发明提供的冷冻干燥法制备微囊化花生四烯酸的工艺，可不改变其激活血小板活性的同时，减少因外界环境变化而引起的花生四烯酸理化性质的改变，提高储藏稳定性，更进一步提高花生四烯酸试剂的灵敏性和开瓶稳定性。