一种提高PD-L1检测灵敏度的方法及其应用

本发明涉及医学检测诊断，具体涉及一种提高pd-l1检测灵敏度的方法及其应用。

背景技术：

1、程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)主要在活化的t细胞上表达，是一种重要的免疫检查点受体。免疫球蛋白样免疫抑制分子，如程序性死亡配体(pd-l1)在多种细胞类型上表达，包括肿瘤细胞、巨噬细胞、树突状细胞和基质细胞。活化t细胞上的pd-1在与肿瘤细胞和肿瘤微环境中的pd-1配体(pd-l1或pd-l2)结合后，向t细胞传递抑制性信号，会抑制cd8 t细胞增殖、细胞因子释放和细胞溶解活性，导致癌细胞逃避免疫监视。肿瘤细胞上的pd-l1与pd-1相互作用，使肿瘤细胞能够逃脱t细胞介导的免疫监视。免疫检查点抑制剂(ici)，包括pd-1/pd-l1抑制剂等，能够阻断免疫检查点之间的相互作用。因此，通过单克隆抗体阻断pd-l1和pd-1相互作用可重新激活肿瘤浸润淋巴细胞(tils)，有助于通过减少免疫逃逸机制来治疗肿瘤。在针对弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)患者的研究中，外周血中pd-1水平(表达百分比)升高与预后较差有关；pd-1tils的量与肿瘤细胞和/或巨噬细胞中pd-l1表达呈正相关。dlbcl中，阻断pd-l1会导致t细胞的ifnγ分泌增强；在体外用抗pd-l1抗体或pd-1融合蛋白阻断pd-l1，能恢复非霍奇金淋巴瘤的肿瘤部位部分的t细胞增殖。dlbcl患者在接受pd-1/pd-l1抑制剂和r-chop、dinaciclib、car t细胞等其它治疗途径的联合治疗时，病人缓解率可得到明显的提高。尽管pd-1/pd-l1抑制剂在dlbcl患者治疗中展示了其有效性，但是，对dlbcl治疗的报道仍然较少，可能源于对pd-1/pd-l1抑制剂临床应用的标准不够精准。因此，仍需要探究能否出现更好的检测指标，更加灵敏、精准的指导pd-1/pd-l1抑制剂在肿瘤病人的临床应用。

2、通过对肿瘤患者组织进行免疫组化分析pd-l1表达，是指导免疫检查点抑制剂使用的重要标准。然而，现有证据表明，pd-l1水平的评估与抗pd-1/pd-l1治疗存在反应不一致，难以成为很可靠的预测因子。而且，基于目前的pd-l1检测方法，在一些研究中pd-l1阳性和pd-l1阴性患者均能从免疫治疗中获益，这说明了目前的pd-l1检测方法的检测准确性或有效性存在一定的误差。而且，在对临床样本进行免疫组化检测时，对pd-l1抗体的选择，不同的实验室也不尽相同，检测灵敏度也存在较大的差异。因此，开发一种能够提高pd-l1检测灵敏度的方法对于基于pd-1/pd-l1抑制剂相关的治疗及研究具有极为重要的意义。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供一种提高pd-l1检测灵敏度的方法及其应用。该方法通过对程序性死亡受体-配体1(programmed cell death 1ligand 1，pd-l1)进行特异性的去糖基化处理，应用对应的特异性抗体(一抗)进行孵育后，显著增强了pd-l1信号强度，以此提高了其在临床检测灵敏度和特异性，为免疫检查点pd-l1的检测以及指导pd-1/pd-l1抑制剂的临床治疗提供了有利的技术支持。

2、本发明的第一个方面，提供一种提高pd-l1检测灵敏度的方法，所述方法包括：

3、采用免疫组化方法进行pd-l1检测，在抗原修复步骤后进行糖蛋白变性，然后进行去糖基化处理，终止去糖基化反应，封闭液封闭后，加入与糖基化位点对应的pd-l1一抗，继续后续检测步骤。

4、在本发明的一些实施方式中，所述去糖基化处理为：使用去糖基化酶或糖苷酶孵育12-16h。

5、在本发明的一些实施方式中，所述去糖基化酶或糖苷酶的孵育温度为35～38℃。

6、在本发明的一些实施方式中，本领域技术人员可以根据实际条件情况，合理调整孵育温度并对应调整孵育时间，以获得本发明中所能要求实现的去糖基化效果。

7、在本发明的一些实施方式中，所述去糖基化酶或糖苷酶包括endo h酶和pngase f酶。当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，选择其他的去糖基化酶或糖苷酶，包括但不限于endo h酶和pngase f酶。

8、在本发明的一些实施方式中，所述去糖基化酶或糖苷酶的使用浓度为3％～5％(v/v)。

9、在本发明中，发明人优选了去糖基化最适酶反应条件，评估了pd-l1免疫组化检测最敏感抗体，有效提高了pd-l1检测灵敏度和特异性，使本发明中的方法具有高灵敏度、强特异性、背景清晰、操作方便，适用于石蜡切片及固定的细胞涂片，可用于检测细胞、组织内的特异性抗原等优势。

10、在本发明的一些实施方式中，所述终止去糖基化反应包括：用tbst洗涤。

11、在本发明的一些实施方式中，在终止去糖基化反应后使用过氧化氢进行灭活处理。当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，选择其他的试剂或方式进行灭活处理，包括但不限于使用过氧化氢或醋酸。

12、在本发明的一些实施方式中，所述灭活处理针对组织样本中的过氧化物酶。

13、在本发明的一些实施方式中，所述过氧化氢为过氧化氢溶液，其使用过氧化氢与甲醇配制得到。

14、在本发明的一些实施方式中，所述过氧化氢溶液为甲醇稀释的3％h2o2。

15、在本发明的一些实施方式中，所述灭活处理的处理时间为8～12min。

16、在本发明的一些实施方式中，所述灭活处理的处理时间为10min。

17、在本发明的一些实施方式中，所述灭活处理的温度为室温。

18、在本发明中，术语“室温”是指是指室内温度，一般定义为18～25℃(或300k左右，包括常规定义中的常温及室温的概念)。

19、在本发明的一些实施方式中，所述pd-l1一抗包括购自abcam、novusbiologicals、boster和cst的pd-l1抗体。

20、在本发明的一些实施方式中，所述pd-l1一抗要求至少特异性靶向pd-l1第214-227位氨基酸残基(对应氨基酸序列为：ldpeenhtaelvip)。

21、当然，本领域技术人员也可以根据pd-l1中的糖基化位点(如图1所示)以及选择的去糖基化酶或糖苷酶的靶标选择情况合理选择其他pd-l1一抗，包括但不限于上述的pd-l1一抗。

22、在本发明的一些实施方式中，所述提高pd-l1检测灵敏度的方法具体为：

23、取待测的肿瘤组织，进行石蜡包埋，制备得到病理切片，然后依次进行烤片，脱蜡，水化和抗原修复，加入糖蛋白变性缓冲溶液进行糖蛋白变性处理，加入去糖基化酶或糖苷酶，孵育12-16h，tbst洗涤3次后使用甲醇稀释的3％h2o2灭活，使用封闭液封闭1h，然后依次加入pd-l1一抗和二抗孵育，加入显色剂，苏木素复染细胞核，脱水，封片，即可用于pd-l1结果判定。

24、在本发明的一些实施方式中，所述提高pd-l1检测灵敏度的方法是基于常规免疫组化方法得到，所述免疫组化方法可基于本领域中常规技术手册得到。

25、n连锁糖基化是一种共翻译和翻译后修饰，对蛋白质稳定性、折叠、运输和生理功能具有重要作用。本发明利用发现的n-糖基化有助于维持pd-l1的稳定性，增强pd-1/pd-l1结合能力，同时使pd-l1表达水平上调的效果来实现提高pd-l1检测准确性的效果。而且，还发现细胞表面发生n-糖基化的pd-l1蛋白分子量约占观察到的pd-l1蛋白分子量的52％，因此，去除n-糖基化可以增加pd-l1的检测准确性，更准确地预测pd-1/pd-l1抑制剂的治疗效果，以克服目前现有的检测pd-l1的方法普遍存在灵敏度和特异性低的问题。

26、本发明的第二个方面，提供去糖基化酶或糖苷酶在制备pd-l1检测产品中的应用。

27、在本发明的一些实施方式中，所述去糖基化酶或糖苷酶包括endo h酶和pngase f酶。当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，选择其他的去糖基化酶或糖苷酶，包括但不限于endo h酶和pngase f酶。

28、在本发明的一些实施方式中，所述pd-l1检测产品包括检测试剂。

29、在本发明的一些实施方式中，所述检测试剂包括检测试剂盒。

30、本发明的第三个方面，提供一种pd-l1检测试剂盒，所述pd-l1检测试剂盒中包括去糖基化试剂和对应于去糖基化试剂作用位点的pd-l1一抗。

31、在本发明的一些实施方式中，所述去糖基化试剂包括去糖基化酶或糖苷酶。

32、在本发明的一些实施方式中，所述去糖基化酶或糖苷酶包括endo h酶和pngase f酶。当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，选择其他的去糖基化酶或糖苷酶，包括但不限于endo h酶和pngase f酶。

33、在本发明的一些实施方式中，所述“对应于去糖基化试剂作用位点”具体指所述pd-l1一抗的特异性靶向片段中包括有去糖基化试剂作用位点。

34、在本发明的一些实施方式中，所述pd-l1一抗包括购自abcam、novusbiologicals、boster和cst的pd-l1抗体。当然，本领域技术人员也可以根据pd-l1中的糖基化位点(如图1所示)以及选择的去糖基化酶或糖苷酶的靶标选择情况合理选择其他pd-l1一抗，包括但不限于上述的pd-l1一抗。

35、在本发明的一些实施方式中，所述pd-l1一抗为购自boster的pd-l1抗体，靶向片段包括pd-l1的第214～227位氨基酸残基，所述第214～227位氨基酸残基如seq id no：1所示。

36、本发明的有益效果是：

37、本发明首次提出对程序性死亡受体-配体1(programmed cell death 1ligand 1，pd-l1)进行特异性的去糖基化处理，并通过对应于糖基化位点的特异性抗体(一抗)进行孵育，以此显著增强pd-l1信号强度，提高了其在临床检测灵敏度和特异性，为免疫检查点pd-l1的检测以及指导pd-1/pd-l1抑制剂的临床治疗提供了有利的技术支持。