一种基于乳胶法检测尿液中人类免疫缺陷病毒抗体及戊型肝炎病毒抗原的试剂盒的制作方法

本发明属于生物医学检测，特别是涉及一种基于乳胶法检测尿液中人类免疫缺陷病毒抗体及戊型肝炎病毒抗原的试剂盒。

背景技术：

1、获得性免疫缺陷综合症(acquired immunodeficiency syndrome，aids)简称艾滋病，是由人类免疫缺陷病毒(human immune deficiency virus，hiv)感染所导致的严重传染病。艾滋病病毒的传播途径主要包括血液传播、性接触、毒品注射和母婴传播。在人体内的潜伏期平均为7-10年。hiv感染潜伏期病人没有明显的临床症状，但具有高度的传染性。对hiv进行检测以发现传染源和切断传播途经是防制aids最有效的手段。

2、自1986年首次发现艾滋病病毒感染的各期患者尿液中均存在hiv抗体后，因尿液标本易采集、保存和运输，采样隐蔽性强，可避免采血时意外针刺感染等血液标本无法比拟的优势而一度成为各国学者争相研究报道的话题，也衍生出几款人类免疫缺陷病毒尿液抗体检测试剂盒；但相对于血液标本，尿液中抗体含量微少，因此对于hiv尿液抗体检测的灵敏度要求很高。

3、戊型肝炎病毒感染是引发急性病毒性肝炎最常见原因。全球每年大约有2000万人感染hev，约有7万人死于hev感染相关的疾病。主要通过粪-口途径传播，但也可通过污染的食物、水源引起散发或暴发流行。

4、根据研究发现，患者尿液中可检出hev抗原，其hev orf2抗原水平是血液含量的10倍，表明尿液中戊型肝炎病毒抗原比血液中的检出时间更早，操作更方便。

5、国内已获得注册证的人类免疫缺陷病毒尿液抗体检测试剂盒仅有两款，所用方法学分别为酶联免疫法和胶体金法。酶联免疫法操作步骤复杂、耗时长、必须借助相关仪器设备，操作过程需要严格控制，容易受外界环境的影响而出现错误，并且进行实验的操作人员，必须经过专业培训才能胜任，从而限制了普通用户的使用；胶体金法因所用载体胶体金颗粒大小的限制，灵敏度普遍偏低。戊型肝炎病毒抗原检测试剂，目前已获得nmpa批准的只有一款基于酶联免疫法检测血液中hev抗原试剂盒，检测尿液中戊型肝炎病毒抗原的试剂处于空白。

6、目前，同时检测尿液中hiv抗体以及hev抗原的试剂盒处于空白状态，因此，研发一种可同时检测尿液中hiv抗体以及hev抗原的试剂盒迫在眉睫。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供一种基于乳胶法检测人类免疫缺陷病毒抗体及戊型肝炎病毒抗原的试剂盒，具有使用方便、操作简单、便于推广的优点，且检测样本为尿液，无创采样，避免因采血等使用方式造成的交叉感染，可实现一份样本同时检测hiv抗体和hev抗原。

2、第一方面，本技术提供一种基于乳胶法检测尿液中人类免疫缺陷病毒抗体及戊型肝炎病毒抗原的试纸条，采用如下的技术方案：

3、一种基于乳胶法检测尿液中人类免疫缺陷病毒抗体及戊型肝炎病毒抗原的试纸条，所述试纸条包括底板、样品垫、乳胶垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品垫、乳胶垫、硝酸纤维素膜和吸水垫按层析方向顺次搭接粘贴在底板上，硝酸纤维素膜上设有质控线以及两条检测线，质控线包被有羊抗鼠igg，两条检测线分别包被有链霉亲和素sa以及hev单克隆抗体2，乳胶垫上包被有胶乳标记的gp41、gp36、gp120混合抗原、gp160抗原和hev单克隆抗体1，样品垫上包被有生物素偶联的spa。

4、质控线c线为羊抗鼠igg；两条检测线分别为检测线t1(链霉亲和素sa)、检测线t2(hev单克隆抗体2)。

5、本发明采用间接法法及双抗体夹心原理定性检测人尿液中游离的hiv 1/2抗体以及戊型肝炎(hev)抗原。

6、检测时当样本中存在hiv1/2抗体时，样本中hiv1/2抗体样品垫上偶联生物素(sb)的spa相互反应，形成sb-spa-抗体结合物，结合物再与乳胶垫上的乳胶标记的gp41、gp36、gp120混合抗原、gp160抗原相互反应，形成标记抗原-抗体-spa-sb复合物，复合物通过毛细作用向上层析，被包被在硝酸纤维素膜上的检测线t1(链霉亲和素sa)捕获，出现红色条带。复合物继续向上层析，被包被在硝酸纤维素膜上的质控线(c线)抗体(羊抗鼠igg)捕获，出现红色条带。当样本中待测物含量低于最低检测限时，检测线t1不显色。

7、检测时当样本中存在hev抗原时，样本中hev抗原与乳胶垫上的乳胶标记的hev单克隆抗体1相互反应，形成标记抗体-抗原复合物，复合物通过毛细作用向上层析，被包被在硝酸纤维素膜上的检测线t2(hev单克隆抗体2)捕获，出现红色条带。复合物继续向上层析，被包被在硝酸纤维素膜上的质控线(c线)抗体(羊抗鼠igg)捕获，出现红色条带。当样本中待测物含量低于最低检测限时，检测线t2不显色。

8、优选的，生物素偶联spa的制备工艺如下：向生物素中加入spa进行反应1-2小时，透析，得到生物素偶联的spa。

9、优选的，生物素的加入量为0.8-1.2ml；例如：0.8ml、0.9ml、1ml、1.1ml或1.2ml。

10、优选的，spa的加入量为0.4-0.6ml；例如0.4ml、0.5ml或0.6ml

11、优选的，样品垫上包被有生物素偶联spa的制备方法如下：用样品处理液对样品垫进行处理，其中，样品处理液包括以下质量浓度的原料：12-24g/l tris、5-10g/l海藻糖、5-10g/lcasein、5-10g/l吐温-20、5-10g/l表面活性剂s7、2.5-5g/l edta、5-10g/l cmc、5-10g/l生物素偶联的spa。

12、本技术中通过将生物素偶联的spa处理在样品垫上，当样本中含有hiv 1/2抗体时，spa偶联hiv 1/2抗体，使hiv 1/2抗体的有序性增强，即fab端一致向外，增加有效抗体的数量，增强hiv 1/2抗体与乳胶标记的gp41、gp36、gp120混合抗原、gp160抗原的结合能力，形成sb(生物素)-spa-抗体-抗原-乳胶复合物；同时利用生物素放大系统，增强检测线t1对于复合物的捕获能力，从而有效提高了产品的灵敏度。

13、样品处理液中加入的cmc，是一种性能优良的增稠剂，可以有效降低尿液样本的爬速，使尿液样本与胶体硒偶联物在到达检测线前有更多的时间充分结合反应，从而有效提高了产品灵敏度。

14、优选的，胶乳标记的gp41、gp36、gp120混合抗原、gp160抗原和hev单克隆抗体1的方法如下：

15、(1)将羧基乳胶、mes、edc和nhs进行混合10-20min，离心；

16、(2)加入mes、稳定剂混匀，得到乳胶溶液；

17、(3)向胶乳溶液中加入gp41、gp36、gp120混合抗原、gp160抗原、hev单克隆抗体1进行反应1-3h，加入封闭液进行反应0.5-1h，得到胶乳标记的gp41、gp36、gp120混合抗原、gp160抗原和hev单克隆抗体1。

18、优选的，步骤(1)中羧基乳胶的加入量为80-120μl；mes的加入量为0.8-1.2ml；edc的加入量为0.8-1.2mg；nhs的加入量为8-12mg；步骤(2)中mes的加入量为0.8-1.2ml，步骤(3)中gp41、gp36、gp120混合抗原的加入量为160-300μg；gp160抗原的加入量为160-300μg；hev单克隆抗体1的加入量为160-300μg；封闭液的加入量为80-120μl。

19、优选的，步骤(2)中稳定剂的加入量为10-20μl；例如10μl、11μl、12μl、13μl、14μl、15μl、16μl、17μl、18μl、19μl或20μl。

20、优选的，步骤(2)中稳定剂为pvp40、pva、sds、ctab中至少一种。

21、本技术中加入的稳定剂对乳胶偶联物的分子形态产生一定影响，从而改变溶液的流变性质，在一定浓度下，所构成的微环境具有良好的悬浮分散和稳定作用；可以有效减少偶联物聚集成不均匀的大颗粒，提高产品特异性；同时因为颗粒分散均匀，可以使得乳胶微球与蛋白的结合更充分，提高产品灵敏度。

22、优选的，步骤(3)中封闭液制备方法如下：

23、s1、将mpeg-cooh、纯化水进行混合8-12min，

24、s2、加入edc、nhs进行混合10-15min；

25、s3、加入氨基酸进行混合1-2h，得到封闭液。

26、优选的，步骤s1中mpeg-cooh的加入量为0.8-1g，纯化水的加入量为8-12ml；步骤s2中edc的加入量为1-3mg；nhs的加入量为4-12mg；

27、优选的，步骤s3中氨基酸的加入量为1.6-2g；例如1.6g、1.7g、1.8g、1.9g或2g。

28、氨基酸为精氨酸、赖氨酸、组氨酸至少一种。

29、所用氨基酸为精氨酸、赖氨酸、组氨酸中的一种，三者都属于碱性氨基酸，自身携带正电荷，可以与胶乳上偶联的蛋白质中带负电荷的部分发生静电吸附，促进封闭；并且氨基酸与mpeg-cooh偶联而成的新物质，由于peg长链，减少空间位阻，封闭更完全，从而有效提高了产品的特异性。

30、在一个具体的可实施方案中，一种基于乳胶法检测尿液中人类免疫缺陷病毒抗体及戊型肝炎病毒抗原的试剂盒制备方法，包括以下步骤：

31、(1)硝酸纤维素膜制备：将hev单克隆抗体2、链霉亲和素(sa)、羊抗鼠igg分别用包被液稀释至0.5-1.2mg/ml，使用划膜仪依次包被在硝酸纤维素膜上对应位置处，45℃烘干2小时；其中包被液的配方如下：2.4g/l tris(ph8.0)、20g/l海藻糖。

32、(2)乳胶偶联物制备方法：选用300nm粒径、固含量4％的红色羧基乳胶，取80-120μl羧基乳胶加入0.8-1.2ml 5mm mes(ph 6.5)，加入0.8-1.2mg edc和8-12mg nhs，20-37℃活化10-20min，离心(温度2-8℃，转速10000-15000rpm，15-30min)弃上清，加入0.8-1.2ml5mm mes(ph6.5)重悬后再加入10-20μl 50g/l的稳定剂混匀，得到胶乳溶液；向胶乳溶液中加入160-300μg gp41、gp36、gp120混合抗原、160-300μg gp160抗原、160-300μg hev单克隆抗体1，20-37℃偶联1-3h；加入80-120μl封闭液封闭0.5-1h，离心(温度2-8℃，转速10000-15000rpm，15-30min)弃上清，加入2ml保存液，得到乳胶偶联物。

33、其中，保存液的配方如下：2.4g/l tris，10g/l bsa，100g/l蔗糖；稳定剂为pvp40、pva、sds、ctab中至少一种。

34、(3)乳胶垫制备方法：将乳胶标记好的偶联物稀释20倍后浸泡空白垫片，取出37℃烘干得到乳胶垫；

35、(4)样品垫的处理：将空白垫片浸泡在样品垫处理液中，取出37℃烘干，所用样品垫处理液配方如下：12-24g/l tris(ph 8.0)、5-10g/l海藻糖、5-10g/l casein、5-10g/l吐温-20、5-10g/l表面活性剂s7、2.5-5g/l edta、5-10g/l cmc、5-10g/l生物素偶联的spa；

36、其中，生物素偶联的spa的制备方法如下：取0.8-1.2ml 20mg/ml的生物素，加入0.4-0.6ml 2mg/ml的spa，室温反应1-2小时；将反应后的液体转移至透析袋中，置于0.01mpbs溶液中，透析24h，期间每隔6h换一次0.01m pbs溶液，得到生物素偶联的spa。

37、(5)试纸条组装：将样品垫、乳胶垫、硝酸纤维素膜和吸水垫按层析方向顺次搭接粘贴在pvc底板上，根据宽度要求裁切后得到试纸条。

38、在一个具体的可实施方案中，封闭液制备方法如下：

39、(1)称取0.8-1g mpeg-cooh于烧杯中，加入8-12ml纯化水，搅拌8-12min；

40、(2)称取1-3mg edc，4-12mgnhs加入烧杯中，搅拌10-15min；

41、(3)称取1.6-2g氨基酸加入烧杯中，搅拌1-2h，得到封闭液。

42、其中，氨基酸为精氨酸、赖氨酸、组氨酸至少一种。

43、第二方面，本技术提供一种试剂盒，采用如下的技术方案：

44、一种试剂盒，包括上述的试纸条。

45、综上所述，本技术包括以下至少一种有益技术效果：

46、本发明公开了一种基于乳胶法检测人类免疫缺陷病毒抗体及戊型肝炎病毒抗原的试剂盒，检测尿液样本，具有使用方便、操作简单、便于推广的优点，无创采样，避免因采血等使用方式造成的交叉感染，可实现1份样本同时检测hiv抗体和hev抗原。