基于二维光学晶格的高分辨率CARS显微成像系统

本发明涉及的是基于二维光学晶格的高分辨率cars显微成像系统，实现不引入外源物质的非侵入、无损伤的多焦点光源的快速生物分子成像，属于生物光子学领域。

背景技术：

1、21世纪是生命科学的世纪。细胞是生命结构和功能的基本单位，对细胞的深入研究是揭示生命现象奥秘、改造生命和征服疾病的关键。目前，生命科学研究的热点之一是在分子水平上阐明单细胞的基本活动规律，这就要求对细胞内种类繁多的生物分子的物理、化学性质及其功能开展系统深入的研究。

2、随着对活体单细胞研究的深入，要求我们以展开生命活动的大环境活细胞作为“试管”，在尽量避免影响活细胞自身性质及其所处微环境的条件下，快速准确地识别单细胞内种类繁多的生物分子，并对其进行精确的定量分析，获取其物理、化学特性和功能信息。因此，研究和发展一种在无需引入外源性标记物的条件下，快速获取活细胞内生物分子的空间分布信息和功能信息，在分子水平上对单细胞的生命活动进行实时、原位、动态检测的光谱分析和显微成像技术，对于研究单细胞的生命活动过程，外界环境对细胞内生物分子的性质、功能和作用的影响，进而探寻生物分子在细胞生命活动过程中的性质、功能及其相互作用动态过程等方面具有重要意义。

3、在远场荧光显微成像技术方面，已经探索实现了多种突破光学衍射极限的远场超分辨荧光显微成像方法。其中，受激发射损耗(stimulated emission depletion，sted)显微镜和荧光饱和结构照明显微镜(structured illumination microscopy，sim)等方法在提高荧光显微成像的空间分辨率方面取得了显著的成功，获得了数十纳米以下的空间分辨率。

4、然而，上述技术在很大程度上依赖于专门设计的外源荧光标记的特性荧光分子通常是外源性的，因此必然会影响细胞内生物分子的运动和代谢过程，从而直接影响细胞的自身性质和生命活动，甚至会产生光致毒性和光致漂白。

5、cars显微成像技术是一种基于待测样品分子固有的振动指纹光谱提供成像对比度的非侵入、无损伤的无标记显微成像技术，具有高灵敏度和时间分辨率等优点。目前，cars显微成像技术已成为生物学、医学和材料科学等众多研究领域中广泛使用的非标记显微成像工具之一，广泛应用于活体细胞和生物组织显微成像研究工作中。然而，由于cars显微成像技术空间分辨率仍在远场光学显微镜光学衍射极限范围内，因此进一步提高cars显微成像技术空间分辨率的需求不断增长。与依赖于专门设计的荧光团特性的超分辨荧光显微成像技术的机理不同，对于实现基于cars光谱的非标记超分辨显微成像技术提出了全新的挑战。

6、国内外众多研究团队在提高cars显微镜空间分辨率方面开展了深入的理论和实验研究工作，并创造性地提出了多种设计方案。这些设计方案还有不足之处，例如：基于能级耗尽原理，在cars非线性光学过程中引入开关机制。但大多数相关研究工作还停留在理论研究和数值模拟阶段，尚未得到实验验证的证实。

7、本发明在已有的cars光谱探测和显微成像技术，以及荧光显微成像技术的理论和实验研究的基础上，提出基于多矢量光场相干叠加调控机制，在物镜视场范围内形成周期排列的，高密度、高强度和激发体积突破光学衍射极限的光学晶胞光场所构成的二维光学晶格作为多焦点激发光源。在各焦点处激发细胞内的特定生物分子产生cars光谱信号，提供化学特异性和成像对比度。通过多焦点扫描方式，实现在无需引入外源性标记物的前提下，以非侵入、无损伤的方式快速准确地识别细胞内部的生物分子，实时原位获取其二维分布图像信息的，具有二维高分辨率的多焦点扫描超分辨cars显微成像系统。

技术实现思路

1、一种基于二维光学晶格光场，以非侵入、无损伤的方式获取高分辨率的多焦点快速扫描成像的cars显微成像系统。

2、本发明的目的是这样实现的：

3、它所述系统中可调谐皮秒激光器1、2和3分别发出特定波长的斯托克斯光、探测光和泵浦光。探测光经过1/2波片4后和一维微位移台6后与经由1/2波片5的泵浦光在合束镜7合为一束光。合束后的激光通过透镜8、9，经偏振分光棱镜10和1/4波片11进入空间光调制器12，空间光调制器12生成特定的光束经过掩膜板13，通过扩束整形系统14进入到物镜15，照射到三维纳米载物台16。斯托克斯光经过扩束整形系统17经过双色镜19进入物镜18，从而照射到三维纳米载物台16。最终在三维纳米载物台16上产生的cars信号从物镜18出发通过双色镜19和短波通滤光片20被emccd相机21接收，并传回计算机22，由计算机22给出测量结果。

4、光学晶格光场是由不同角度入射的多个矢量光场，在同一区域内相干叠加产生的周期性排列的光学晶胞光场所构成的。探测光和泵浦光在待测样品焦平面内分别形成不同对称性、周期和横纵比的二维光学晶格，并使其满足相位匹配。在空间中，入射矢量光场的波矢和强度分别对光学晶格光场的形成产生不同的影响。在凝聚态物理中，倒易晶格的倒易原始矢量和波矢的关系可以表示为：

5、bn＝k0-kn,n＝1,…,d (1)

6、根据上述内容，可以通过控制叠加光场的数量和波矢方向产生想要得到的满足相位匹配的二维光学晶格。先定义直接晶格的原始晶胞波矢an，令a＝[a1,…,ad]。且倒易晶格的原始晶胞波矢bn，令b＝[b1,…,bd]。由b'i·aj＝2πδij(即下标相同右侧等于2π，否则右侧结果为0，其中b'i即为倒易向量)可以得到：

7、k0＝a·β/4π (2)

8、根据公式(1)和(2)可以得到波矢集{kn}，它包含了晶格的方向和周期性的信息。结合上面所述，根据设计的需求选择不同的晶胞形状的直接原始晶胞矢量an和波矢kn来生成满足相位匹配的二维光学晶格。

9、cars信号的产生来源于系统使用波长可调谐皮秒激光器1、2和3输出特定中心频率的近红外波长激光脉冲分别作为全场照明的斯托克斯光、二维光学晶格形式的探测光和泵浦光。通过调节激光器输出的中心波长，即可实现能量守恒条件。激光光束在大数值孔径物镜15的后焦平面内的特定位置处入射，通过物镜15以不同角度在视场范围内的待测样品中相干叠加形成不同类型的满足相位匹配的二维光学晶格多焦点激发光源。作为斯托克斯光的近红外波长激光脉冲经扩束整形系统17，在另一个大数值孔径的物镜18的后焦平面成像，在物镜18的整个视场范围内形成全场照明。二维晶格光场叠加形成的多焦点激发光源与全场照明的斯托克斯光形成生成cars信号的复合光场。以特定传播方向的二维光学晶格使总光场能够同时满足四波混频的动量守恒的条件，最终探测到cars信号。

10、由cars非线性光学过程的原理可以知道，cars信号的强度正比于待测样品的三阶非线性极化率，其中包含共振部分(χ(3)r)和非共振部分(χ(3)nr)，如公式(3)所示：

11、

12、伴随cars信号同时存在的非共振背景(nonresonant background,nrb)噪声大大降低了系统的探测灵敏度、光谱分辨率和图像对比度。尤其在宽带激发条件下，强度较大的nrb噪声往往会淹没感兴趣的生物分子的较弱的cars信号，不利于准确识别生物分子。

13、调节皮秒脉冲激光器1和3输出的激光脉冲的中心波长，当斯托克斯光和泵浦光的频率差与特定物质分子振动模式的振动频率一致时，各晶胞光场范围内的物质分子振动模式得到共振增强。因为时间一致的泵浦光和斯托克斯光脉冲与样品相互作用，所以产生同时包含共振和非共振部分的分子振动状态。非共振状态在频域中具有平坦的响应特性，在时域中具有瞬时的峰值响应特性。与非共振状态相比，在共振状态中包括一个实际振动状态的跃迁，具有较长的退相时间(在液体和固体中约为数皮秒至十几皮秒，在气体中约为几百皮秒)。因此，在cars光谱分析和显微成像技术中，探测器接收到的时域波形的起始阶段存在强的nrb噪声，掩盖了有用的cars信号。

14、基于一维微位移台6精确控制同时到达的泵浦光和斯托克斯光激光脉冲与探测光激光脉冲之间的时间延迟，实现在多焦点激发条件下的时间分辨方法。通过选择最佳的时间窗口，在尽量避免有用信号损失的前提下，有效抑制伴随cars光谱信号的nrb噪声，从而达到提高系统的光谱分辨率、探测灵敏度和成像对比度的目的。皮秒脉冲激光器2输出的激光脉冲作为探测光与共振增强的分子振动模式混合，各晶胞光场激发产生的前向cars光谱信号由物镜18收集，经短波通滤光片20消除激光和背景噪声，由emccd相机21探测接收。基于探测得到的cars光谱信号提供化学特异性和成像对比度，调节三维纳米载物台16实现二维光学晶格光场在待测样品中的快速扫描，获取待测样品中特定分子二维的高分辨率图像