实时荧光定量仪荧光强度试验方法与流程

本发明涉及荧光强度试验相关，具体为实时荧光定量仪荧光强度试验方法。

背景技术：

1、实时荧光pcr是一种基于聚合酶链式反应的技术，用于检测和量化dna或rna的分子数量，实时荧光pcr具有高灵敏度、高特异性和高准确性的优点，广泛用于基因表达分析、病原体检测、基因突变分析、药物筛选等领域。

2、传统的实时荧光pcr实验方法，在实验时容易受到各种外界因素影响，如荧光定量仪的参数设置校准以及样品摆放位置都会对实验结果造成不可预料的影响，同时在实验数据处理时，难以将错误数据和图表筛除，造成实验成功率低，遇到意外干扰时可能需要多次重复才能完成实验，导致实验效率低下。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供实时荧光定量仪荧光强度试验方法，以解决上述背景中所提出传统的在线咨询系统需要大量的客服人员来对顾客进行服务的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：实时荧光定量仪荧光强度试验方法，所述试验方法包括如下步骤：

3、s1.准备样品：在进行实时荧光强度试验之前，首先准备待测样品，样品包括生物学样品、化学样品或环境样品，在准备样品时，需要采用特殊的制备和处理方法，确保样品的质量和稳定性，对于生物学样品，需要进行培养、处理或预处理，以获得所需的荧光信号；

4、s2.设置实验条件：在进行实时荧光强度试验之前，先设置合适的实验条件，所示实验条件包括温度、湿度和光照，在设置实验条件时，根据样品的特性和实验要求进行优化；

5、s3.准备实时荧光定量仪：在进行实时荧光强度试验之前准备好实时荧光定量仪，首先根据实验需求选择符合实验要求的实时荧光定量仪，选择不同型号和规格的实时荧光定量仪，来满足不同样品和实验要求，且在实验前对实时荧光定量仪进行预热，以获得准确和可靠的测量结果；

6、s4.校准仪器：在进行实时荧光强度试验之前，对实时荧光定量仪进行校准，校准过程中，首先进行背景荧光校正和荧光强度基线的设置，背景荧光校正是通过测量没有荧光信号的背景样品，然后将其荧光信号减去样品的荧光信号，以消除背景荧光的影响，荧光强度基线的设置是将荧光信号的最小值设置为零，以确保荧光信号的准确性和可比性；

7、s5.设置实时荧光定量仪参数：在进行实时荧光强度试验之前，需要设置实时荧光定量仪的参数，所述参数包括荧光激发波长、荧光检测波长和采集时间，所述荧光激发波长是指用于激发样品荧光的光波长，通常通过选择适当的滤光片或光源来实现，所述荧光检测波长是指用于检测和接收样品荧光的光波长，也可以通过选择适当的滤光片或光探测器来实现，所述采集时间是指每次荧光信号采集的时间，根据样品的荧光强度和稳定性来确定；

8、s6.放置样品：在进行实时荧光强度试验之前，需要将样品放置到实时荧光定量仪的样品舱中，所述样品舱是一个容器，用于容纳样品并与荧光探测器接触，在放置样品时，确保样品与荧光探测器之间的距离适当，并且样品的位置稳定，使用样品舱的盖子或夹具来固定样品的位置；

9、s7.开始测量：在进行实时荧光强度试验之前，启动实时荧光定量仪，并做一些准备工作，然后开始进行荧光强度测量，根据实验需求，选择连续测量样品的荧光强度，并记录实时荧光数据，在测量过程中，确保实时荧光定量仪的稳定性和准确性，通过观察实时荧光数据的变化来判断样品的荧光强度和变化趋势；

10、s8.数据分析：在完成实时荧光强度试验后，需要对实时荧光数据进行分析，数据分析的目的是计算样品的平均荧光强度、荧光增幅曲线、荧光衰减曲线和扩增曲线；

11、s9.结果解读：根据实时荧光数据的分析结果，进行结果解读；结果解读的目的是根据荧光强度的变化推断样品的特性和反应过程；

12、s10.结果展示：在完成实时荧光强度试验和结果解读后，将实验结果整理并展示，所述实验结果展示采用图表、表格、图像和报告相结合的形式；

13、s11.清洗和维护：在完成实时荧光强度试验和结果展示后，需要进行实时荧光定量仪的清洗和维护工作，除去样品残留物和污染物，以保持仪器的正常使用和准确性。

14、进一步地，所述样品处理方法包括：

15、细胞培养：对于样品是细胞，首先需要进行细胞培养，将细胞放置在含有适当培养基、营养物和培养条件的培养皿中，使其保持生长和增殖，在培养过程中定期更换培养基，保持细胞的营养供应和生长环境的稳定，在培养细胞期间，添加荧光探针或荧光标记物，以标记细胞或特定的细胞组分；

16、细胞处理：在培养细胞后，对细胞进行处理以获得所需的荧光信号，处理的方法包括药物处理、基因转染和蛋白表达；

17、组织处理：当样品是组织时，采用组织处理的方法来获得所需的荧光信号，所示组织处理的方法包括切片、染色或者抗体标记；

18、样品预处理：为了获得所需的荧光信号，需要对样品进行预处理，所示预处理的方法包括固定、清洗和处理；

19、共培养：对于一些细胞类型或组织样品，需要进行共培养来模拟其在体内的相互作用或相互影响，共培养通过将不同类型的细胞或组织样品放置在同一培养皿中，并提供适当的培养条件来实现，用以促进细胞间的相互作用，并产生特定的荧光信号；

20、荧光探针或标记物的使用：在进行实时荧光强度试验之前，使用适当的荧光探针或标记物来标记样品中的特定分子或结构，荧光探针包括化学染料、荧光蛋白和荧光标记抗体；

21、荧光显微镜观察：在进行实时荧光强度试验之后，使用荧光显微镜来观察样品中的荧光信号。

22、进一步地，所述s4中提到的仪器校准中所需要注意事项包括波长校准、使用荧光标准品、背景校准、参考样本校准、读数参数设置、校准的频率和文档记录。

23、进一步地，所述s5中对于荧光激发波长、荧光检测波长和采集时间的选择基于以下几个因素：

24、荧光染料的特性：首先确定所使用的荧光染料的激发和发射波长，根据荧光染料的光谱特性，选择合适的激发波长和检测波长，使得激发波长与染料的最大吸收波长相匹配，同时检测波长与染料的最大发射波长相匹配；

25、仪器的可用通道：根据实验需求和所使用的荧光染料的数量，选择相应的荧光通道进行激发和检测；

26、背景信号的最小化：根据实验样本的特性和所使用的荧光染料，选择与样本中的自发荧光信号相差较大的激发波长和检测波长以最小化背景信号；

27、荧光信号的强度和稳定性：根据荧光信号的强度和稳定性，选择适当的采集时间，使得采集时间足够长以确保荧光信号的稳定性和准确性，但又不能过长以避免信号的逐渐衰减或淬灭。

28、进一步地，所述s6中样品与荧光探测器之间的距离选定参考因素包括：

29、仪器的焦距和聚焦：根据仪器的光学系统和焦距，确定样品与荧光探测器之间的最佳距离，放置时样品尽可能接近荧光探测器的焦平面；

30、焦点调节：根据荧光染料的荧光信号强度和荧光标记的细胞或分子的分布，调整样品与荧光探测器之间的距离，将样品与荧光探测器放置在焦点的前方或后方；

31、光路设计：根据仪器的设计和要求，确保样品与荧光探测器之间的距离在光学路径的范围内；

32、防止信号损失：避免样品与荧光探测器之间的距离过大，使用镜头或适配器来调整样品与荧光探测器之间的距离，以保持信号强度。

33、进一步地，所述s7中开始测量之前的准备工作包括：

34、仪器预热：在开始测量之前，让实时荧光定量仪预热一段时间，以确保仪器的温度稳定；

35、稳定性检查：在开始正式测量之前，通过测量一个稳定的样品或质控样品来进行稳定性检查，确保荧光信号在一段时间内保持稳定，并没有明显的波动或漂移；

36、重复性检查：在开始测量之前，通过测量同一样品的多个重复样本来进行重复性检查，以确保测量结果的一致性和可重复性。

37、进一步地，所述平均荧光强度是通过计算多次测量的荧光强度值的平均值来得到的，以提高结果的可靠性和准确性；

38、所述荧光增幅曲线是通过绘制荧光强度与时间的关系曲线来得到的，用于评估样品的荧光增强或减弱情况；

39、所述荧光衰减曲线是通过绘制荧光强度与时间的关系曲线来得到的，用于评估样品的荧光衰减或消失情况；

40、所述扩增曲线是通过绘制荧光强度与pcr循环数的关系曲线来得到的。

41、进一步地，所述扩增曲线的斜率和起始模板浓度有关，斜率越陡峭表示扩增效率越高，起始模板浓度越高；在对扩增曲线进行分析时通过计算pcr产物的累积速度和扩增效率来计算起始模板浓度；通过斜率的计算来得到pcr反应的扩增效率；通过绘制荧光强度与pcr循环数的关系曲线来得到pcr反应的动力学特性和扩增效率。

42、进一步地，所述s9中在进行结果解读时，按照以下步骤进行：

43、确定实验目的和背景知识：了解实验的目的和研究对象，掌握相关的背景知识，以便更好地解读结果；

44、观察荧光强度变化曲线：根据实时荧光数据，观察荧光强度随时间的变化曲线，注意荧光强度的增减趋势以及变化的速率，将荧光强度曲线与对照组进行比较，以了解样品中的变化情况；

45、分析荧光强度变化的原因：根据实验目的和背景知识，分析荧光强度变化的原因，考虑可能的影响因素，例如样品中的物质积累、反应的进行和物质的消失；

46、得出结论：根据观察和分析的结果，得出结论并解释实验结果。

47、进一步地，所述s11中对荧光定量仪进行清洗时，使用适当的溶剂和清洗剂对样品舱、光学元件和滤光片进行清洗，在清洗不同的部件时采用不同的溶剂和清洗剂，使用70％乙醇溶液来消毒和清洗仪器表面和附件，如光学透镜、探头和样品架；使用去离子水来清洗光学透镜、探头这样需要高纯度水清洗的部件；使用10％次氯酸钠溶液来消毒和清洗需要高效消毒的部件，如实验室台面和样品架；使用去蛋白酶溶液来清洗需要去除蛋白质残留的部件，如探头；使用洗涤剂来清洗样品架等需要去除污渍的部件：

48、本发明提出的实时荧光定量仪荧光强度试验方法，相较传统的荧光强度试验方法具有以下优势：

49、1.本发明实时荧光定量仪荧光强度试验方法，通过在实验前对实时荧光定量仪进行校准，对参数进行精准设置，可以帮助排除实验中可能的干扰因素，并提供更准确和可靠的实验结果，通过样品放置时的焦距、光路和信号损失的综合考量，使得样品可以放置在最为合适的位置上，可以最大程度地利用样品的信号、确保成像的准确性和稳定性、提高成像分辨率、缩短实验时间、避免信号损失，大幅提升实验效率，从而通过一系列标准化的前期准备，大幅降低了位置因素对上双眼结果的干扰，提升了实验成功率。

50、2.本发明实时荧光定量仪荧光强度试验方法，通过利用算法对实验结果进行分析，通过图表对结果进行归纳总结，可以便捷地找出实验过程中的异常数据和图表，便于发现原因，并对试验方法进行检查和改进，大幅减少了无效的重复试验过程，提升了效率。