一种同时测定婴幼儿辅食米面制品中6种美拉德反应产物的方法与流程

本发明涉及婴幼儿辅食米面制品检测，尤其涉及一种同时测定婴幼儿辅食米面制品中6种美拉德反应产物的方法。

背景技术：

1、美拉德反应是食品中羰基化合物和氨基化合物之间的自然反应，广泛存在于食品的热加工、贮藏及运输过程中，是形成食品香味物质的主要来源之一。研究表明食品在热加工或高温贮存过程中会发生美拉德反应，并产生糠氨酸、糠醛类化合物、丙烯酰胺等。其中糠醛类化合物主要由5-羟甲基糠醛、糠醛、呋喃甲基酮和甲基糠醛4种化合物组成。在美拉德反应过程中，会造成了食品中部分氨基酸降解，并产生一些损害营养的物质，其中部分可能还有毒性。如5-羟甲基糠醛已被证实具有神经毒性，可通过吸入或皮肤接触进入人体，与人体蛋白质相结合产生蓄积而中毒。因此，美拉德反应产物的研究已成为食品研究的焦点之一。

2、目前检测食品中美拉德反应产物的方法有分光光度法、高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱法等，其中分光光度法的前处理复杂，灵敏度较低，无法满足痕量分析需求；液相色谱-串联质谱法准确性高，但是仪器昂贵、成本高；气相色谱法需要柱前衍生化，操作烦琐；高效液相色谱法是最常用的仪器分析方法，被广泛应用于食品中有毒有害物质的分析检测。对于检测食品中的美拉德反应产物，文献多报道于检测乳制品、调味品、蜂王浆等食品，目前针对米面制品中美拉德反应产物的检测研较为少见。

技术实现思路

1、为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种定量、准确、简便的高效液相色谱法同时测定婴幼儿辅食米面制品中的糠氨酸、5-羟甲基糠醛、糠醛、呋喃酮、呋喃甲基酮、甲基糠醛6种美拉德反应产物，优化前处理和液相色谱条件，以填补婴幼儿辅食米面制品中美拉德反应产物检测的空白，为研究婴幼儿辅食米面制品加工、贮藏及运输过程中糠氨酸、呋喃酮及糠醛类物质产生规律，进而评价米面制品品质和新鲜度提供技术支撑。

2、为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：

3、一种同时测定婴幼儿辅食米面制品中6种美拉德反应产物的方法，其特征在于，6种美拉德反应产物为糠氨酸、呋喃酮、5-羟甲基糠醛、糠醛、呋喃甲基酮和甲基糠醛；该方法包括以下的步骤：

4、1）样品前处理

5、称取试样2g，精确至0.0001g，置于50ml离心管中，加入12ml水，涡旋混匀，超声提取30min，振荡20min；加入5ml0.15mol/l草酸溶液，振荡20min；加5ml40g/100ml三氯乙酸溶液，振荡10min，4000r/min离心5min，取上清液至25ml容量瓶；向剩余残渣加入5ml4g/100ml的三氯乙酸溶液，涡旋混匀后振荡10min，4000r/min离心5min，合并上清液，加入4g/100ml三氯乙酸溶液定容至刻度，摇匀，取适量溶液过0.45μm滤膜后，供高效液相色谱仪分析；

6、2）色谱条件

7、色谱柱：agilenteclipsexdb-c18，150mm×4.6mm，5μm；流动相：乙腈-0.1%三氟乙酸溶液梯度洗脱；柱温：30℃；流速：0.6ml/min；检测波长：280nm；进样量：5μl；

8、所述的梯度洗脱程序如下：

9、 时间min 乙腈% 0.1%三氟乙酸溶液% 0 1 99 5 1 99 10 10 90 15 15 85 20 50 50 25 1 99 30 1 99

10、作为优选，10mg/ml标准储备溶液的制备方法如下：分别准确称取0.1000g，精确至0.1mg，糠氨酸、糠醛、5-羟甲基糠醛、2-乙酰呋喃、5-甲基糠醛标准品，用水充分溶解并定容至10ml容量瓶中，配制成浓度为10mg/ml的标准储备溶液；称取0.1000g，精确至0.1mg呋喃酮，用甲醇充分溶解并定容至10ml容量瓶中，配制成浓度为10mg/ml的标准储备溶液，于4℃冷藏储存。

11、作为优选，100μg/ml混合标准中间液的制备方法如下：分别准确移取100μl上述各标准储备溶液，于10ml容量瓶中，加水定容，配制成浓度为100μg/ml混合标准中间液。

12、作为优选，标准工作溶液的制备方法如下：分别准确移取一定量的上述混合标准中间液，用水溶液溶解逐级稀释至0.2、0.4、0.8、2.0、4.0μg/ml糠醛、5-羟甲基糠醛、2-乙酰呋喃、5-甲基糠醛，0.4、0.8、1.6、4.0、8.0μg/ml呋喃酮，0.8、1.6、3.2、8.0、16μg/ml糠氨酸的系列标准工作溶液，1℃～4℃冰箱避光保存，有效期3个月。

13、作为优选，该方法还包括将配制好的系列标准工作溶液依次进入液相色谱检测，以质量浓度作为横坐标（x），峰面积作为纵坐标(y)进行线性回归，所得线性范围、线性方程、相关系数和定量限结果如下：

14、 化合物 线性范围/(mg/l) 线性方程 相关系数 定量限/(μg/100g) 糠氨酸 0.8-16.0 y=0.0003x 0.9995 1000 5-羟甲基糠醛 0.2-4.0 y=0.0008x 0.9992 250 糠醛 0.2-4.0 y=0.0001x 0.9992 250 呋喃酮 0.4–8.0 y=0.0003x 0.9992 500 呋喃甲基酮 0.2-4.0 y=0.0007x 0.9991 250 甲基糠醛 0.2-4.0 y=0.0009x 0.9995 250

15、作为优选，该方法还包括采用分别在不含有美拉德反应产物的空白面粉样品中添加标准溶液的方法进行添加回收率和方法的精密度测定，糠氨酸的添加水平分别为1000、2000、10000μg/100g，5-羟甲基糠醛,糠醛,呋喃甲基酮，甲基糠醛的添加水平分别为250，500，2500μg/100g，呋喃酮的添加水平分别为500、1000、5000μg/100g，平行测定6次，计算加标回收率及rsd；6种目标化合物的回收率范围为71.2%~100%，rsd( n=6)范围为0.9%~4.9%。

16、本发明由于采用了上述的技术方案，建立高效液相色谱-二极管阵列检测法同时测定婴幼儿辅食米面制品中糠氨酸、呋喃酮及4种糠醛类化合物（5-羟甲基糠醛、糠醛、呋喃甲基酮、甲基糠醛）的方法。样品经水和草酸溶液提取、三氯乙酸沉淀蛋白后，采用eclipsexdb-c18色谱柱分离，以乙腈-0.1%三氟乙酸溶液为流动相，以流速0.6ml/min进行梯度洗脱，二极管阵列检测器检测，外标法定量。6种组分的线性范围为0.2~16.0mg/l，相关系数大于0.999，方法的定量限为250~1000μg/100g(s/n=10)。6种组分的回收率范围为71.2%~100%，相对标准偏差为0.9%~4.9%。该方法灵敏度高、分离度好，适用于婴幼儿辅食米面制品中美拉德反应产物的同时定量检测。