一种检测母牛自然周期成熟卵泡、诱导排卵配种的方法与流程

本发明涉及一种检测母牛自然周期成熟卵泡、诱导排卵配种的方法，属于动物繁育。

背景技术：

1、现有母牛的繁殖方法有：自然排卵交配、药物诱发排卵交配、同期发情定时输精、胚胎移植等。在规模化生产过程中，通常采用单一的同期发情定时输精的方案，用于对同期发情的多头母牛进行输精配种，这种方式因忽略了牛群中不同牛的生理状态，不完全相同的个体差异性，导致母牛同期发情定时输精后受胎率忽高（50%--60%）忽低（20%--30%），进而存在母牛空怀数量增多、母牛群体产犊间隔延长、繁殖率低下、养殖成本高、养殖场亏损严重等问题。因此有必要对现有技术加以改进。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种检测母牛自然周期成熟卵泡、诱导排卵配种的方法，避免母牛空怀期，缩短母牛产犊间隔，提高母牛群体繁殖率，降低养殖的成本，提升养殖的效益。

2、本发明通过下列技术方案完成：一种检测母牛自然周期成熟卵泡、诱导排卵配种的方法，其特征在于包括下列步骤：

3、1）在母牛配种前5日、48小时、36小时或12小时，采集1--10 ml母牛血，于阴凉处静置1-2小时，分离出血清；

4、2）将牛的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸插入步骤1）的血清中5--10秒，取出，于15-18分钟后，观察该检测试纸中的质控线c与检测线t1、t2是否显色：

5、3）显色结果如下：

6、试纸质控线c未显色、检测线t1或/和t2显色，表明检测结果无效，需要重新检测；

7、试纸质控线c显色，检测线t1或/和t2未显色，表明母牛的lh及fsh水平低下，需要隔日进行检测；

8、试纸质控线c及检测线t1与t2都显色，用该显色与lh及fsh比色卡进行下列对比；

9、31）lh≥10-100 miu/ml, fsh≥30-65miu/ml，表明母牛卵泡≥20毫米，为成熟卵泡，肌注促性腺激素释放激素3毫升，12小时后配种；

10、32）lh≥5-10miu/ml,fsh≥65-100miu/ml，表明母牛卵泡≥7--15毫米，为优势卵泡，肌注孕马血清500-700iu, 36小时后配种；

11、33）lh<5miu/ml, fsh<30miu/ml，表明母牛在黄体期，于5日后，重复步骤1）-3），当试纸质控线c及检测线t1与t2都显色，用该显色与lh及fsh比色卡进行对比后，按31）或者32）处理；

12、34）步骤33）对比后依旧lh<5miu/ml, fsh<30miu/ml，表明母牛还是处于黄体期，肌注前列腺素f2a 1.5毫升，48小时后，再次重复步骤1）-3），当试纸质控线c及检测线t1与t2都显色，用该显色与lh及fsh比色卡进行对比后，按31）或者32）处理；

13、35）步骤34）对比后依旧lh<5miu/ml, fsh<30miu/ml，表明母牛卵巢静止不育，该母牛不作为种牛，另行处理。

14、所述步骤2）牛的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸，经过下列方法制备：

15、21）按下列制备各组分：

16、金溶液：将质量浓度为2%的氯金酸溶液20ml、质量浓度为1%的柠檬酸钠加入纯化水至100ml，加热至溶液呈现紫红色后，冷却至室温，得金溶液；

17、封闭液：将0.005g牛血清白蛋白溶解在300ul纯化水中，加入30ul 碳酸钾溶液，混合均匀，得330ul封闭液；

18、样本垫处理液：将0.605g三羧甲氨基甲烷、1.5g氯化钠完全溶解在100ml纯化水中，得样本垫处理液；

19、胶体金结合物稀释液：将0.605g三羧甲氨基甲烷，0.2g聚乙烯吡咯烷酮，5g蔗糖，0.9g氯化钠，0.5g牛血清白蛋白，3ml羊血清，0.15ml吐温20，与100ml纯化水混合均匀，得胶体金结合物稀释液；

20、lh包被液：将100-200mg牛的黄体生成素单克隆α亚级抗体lhmabcoating、质量浓度为1%的海藻糖溶液1ml溶解在0.01m pbs缓冲液100ml中，混合均匀，得lh包被液；

21、fsh包被液：将100-200mg牛的fsh单克隆α亚级抗体fshmabcoating、质量浓度为1%的海藻糖溶液1ml溶解在0.01m pbs缓冲液100ml中，混合均匀，得fsh包被液；

22、igg包被液：将羊抗鼠igg抗体100mg、质量浓度为1%的海藻糖溶液1ml溶解在0.01mpbs缓冲液100ml中，混合均匀，得igg包被液；

23、22）在底板上划膜

24、22a）将nc膜贴在pvc板上表面的中部，得底板；

25、22b）用xyz3010喷金划膜仪，并按0.8μl/cm的量，以500mm/s的速度，将igg包被液均匀地划在步骤22a）底板上的nc膜的上端作为质控线c，将lh包被液均匀地划在nc膜的中部作为检测线t1，质控线c与检测线t1相距3mm±1mm；将fsh包被液均匀地划在nc膜的下端作为检测线t2，检测线t1与检测线t2相距3mm±1mm；质控线c距离nc膜上端8mm±1mm，检测线t2距离nc膜下端7mm±1mm，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得划膜板；

26、23）金垫制备

27、23a）在100ml步骤21）的金溶液中加入1.2ml碳酸钾溶液、1.5-2mglhmb2与fshmb4搅拌40min，滴加330ul封闭液，搅拌10min，于4℃、12000r/min的条件下离心40min，直至上清液变为水，弃上清液，取余液5.3 ml，加入40ml 胶体金结合物稀释液混匀，形成lhmb2及fshmb4复合胶体金结合物稀释溶液；

28、23b）将40ml lhmb2及fshmb4复合胶体金结合物稀释液均匀铺在1080cm2玻璃纤维素膜rb65上，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得金垫；

29、24）样本垫制备

30、24a）按30ml/张的量，将步骤21）的样本垫处理液均匀铺在玻璃纤维素膜sb06上，然后放入干燥箱内，于温度为25℃±2℃、湿度≤30％下干燥18h±2h，得样本垫；

31、25）贴板

32、25a）将步骤23）的金垫贴于步骤22b）划膜板的nc膜下端，并使1-2mm的金垫后端搭在nc膜上；

33、25b）将步骤24）的样本垫贴于步骤25a）的金垫前端上面，并使样本垫后端完全搭在金垫上，样本垫前端贴于pvc板前端；

34、25c）将吸水垫贴于25b）的pvc板后端，并使1-2mm的吸水垫前端搭在nc膜后端；

35、26）将步骤25c）贴板切割成3.0±0.5mm的试纸条，得牛的促黄体生成素lh及卵泡刺激素fsh检测试纸。

36、本发明具有下列优点和效果：采用上述方案，可方便、简单、快速、准确地检测出母牛的卵泡大小，进而根据不同大小的卵泡诱导排卵、配种，有效避免母牛空怀期，缩短母牛群体产犊间隔，提高母牛群体繁殖率，降低养殖成本，优选高繁殖力的母牛群体，高质量提升母牛产犊效率，纯化后代母牛群体基因，从而为增加养殖效益提供可靠的技术支持。