一种白介素6的均相检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于均相检测，具体涉及一种白介素6的均相检测试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术：

1、白介素6(il-6)是一种功能广泛的多效细胞因子，对b细胞、t细胞、造血干细胞、肝细胞和脑细胞均有生理活性作用。白介素6为单基因表达，包含212个氨基酸序列，且氨基末端易裂解形成184个氨基酸的多肽，分子量约为22-27kd。临床上在内外伤、外科手术、感染等急性炎症反应过程中会快速升高，在类风湿关节炎等慢性炎症中也有作用，也能用于评估脓毒症等的监测和预后情况，主要用于监测机体的免疫状态、炎症反应等。

2、对于白介素6的检测法，不论放射免疫分析(ria)、酶免疫分析(eia)，还是化学发光免疫分析，由于标记抗体为过量，检测前均需要去除未参加反应的标记抗体。现有非均相免疫分析法都需要繁琐的洗涤步骤；同时，需要克服放射免疫分析环境污染、货架期短、酶免疫分析重复性差等缺陷。

3、均相免疫分析技术中无需分离洗涤步骤，可显著提高检测的准确度，并缩短检测时间，然而目前公开报道的基于均相化学发光检测白介素6的试剂盒，例如cn106124769a，存在如下技术问题：(1)抗体与感光微粒偶联的效率较低；(2)包被抗体的感光微粒直接与包被抗体的发光微粒作为试剂反应，相对于抗体，微粒体积庞大，形成位阻使得反应速率低，短时间反应不充分，线性短；(3)难以同时兼顾高灵敏度和宽检测量程。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供了一种白介素6的均相检测试剂盒，其测定的主体体液中il-6标志物的定量结果可以用于监测机体的免疫状态、炎症反应，既有较合适的灵敏度，又有很宽的检测量程。

2、为此，本发明第一方面提供了1.一种白介素6的均相检测试剂盒，其包括试剂1和试剂3，所述试剂1包含第一缓冲溶液以及悬浮于其中的受体颗粒，所述受体颗粒与白介素6抗体结合，其能够与活性氧作用产生化学发光；所述试剂3包含第二缓冲溶液以及悬浮于其中的供体颗粒，所述供体颗粒与特异性配对成员中的一员结合，其特征在于：所述受体颗粒包括第一载体，所述第一载体的内部填充有发光组合物，所述第一载体的表面键合有白介素6抗体，所述白介素6抗体能够与白介素6特异性结合；所述受体颗粒在试剂1中的粒径分布变异系数c.v值不低于5％且不高于20％；所述供体颗粒包括第二载体，所述第二载体的内部填充有敏化剂，所述第二载体的表面键合有特异性配对成员中的一员；所述供体颗粒在试剂3中每克所述供体颗粒中的糖含量不高于40mg。

3、在本发明的一些实施方式中，所述受体颗粒在试剂1中的粒径分布变异系数c.v值不高于15％。

4、在本发明的一些具体实施例中，所述受体颗粒在试剂1中的粒径分布变异系数c.v值可以选自5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％和20％。

5、在本发明的一些实施方式中，所述第一载体的表面包被有多糖，所述白介素6抗体通过与多糖分子的键合而结合到第一载体上。

6、在本发明的一些实施方式中，所述第一载体的表面包被至少两个连续多糖层的涂层。

7、在本发明的一些实施方式中，所述涂层的第一多糖层与第二多糖层自发关联。

8、在本发明的一些实施方式中，所述涂层中的每一层多糖具有官能团，所述多糖层的官能团与前一多糖层的官能团所带电荷相反。

9、在本发明的另一些实施方式中，所述涂层中的每一层多糖具有官能团，每一多糖层通过其官能团与前一多糖层上的官能团之间的反应从而与前一多糖层共价连接。

10、在本发明的一些实施方式中，所述涂层的最外一层多糖层具有至少一个侧基官能团，其与白介素6抗体键合。

11、在本发明的一些实施方式中，所述涂层的最外一层多糖层的侧基官能团选自醛基、羧基、巯基、氨基、羟基和马来胺基中的至少一种。

12、在本发明的一些优选实施方式中，所述涂层的最外一层多糖层的侧基官能团选自醛基和/或羧基。

13、在本发明的一些实施方式中，每升所述第一缓冲溶液中的糖含量为0.01-1g。

14、在本发明的一些优选实施方式中，每升所述第一缓冲溶液中的糖含量为0.02-0.2g。

15、在本发明的一些实施方式中，每克所述受体颗粒的糖含量不低于20毫克。在本发明的一些具体实施例中，每克所述受体颗粒的糖含量可以选自20.7毫克、40毫克、42.5毫克、59.8毫克、61.3毫克。

16、在本发明的一些优选实施方式中，每克所述受体颗粒的糖含量不低于40毫克。

17、在本发明的一些实施方式中，所述多糖选自含有三个或三个以上未修饰或修饰的单糖单元的碳水化合物；优选选自葡聚糖、淀粉、糖原、菊粉、果聚糖、甘露聚糖、琼脂糖、半乳聚糖、羧基葡聚糖和氨基葡聚糖中的至少一种；更优选选自葡聚糖、淀粉、糖原和聚核糖中的至少一种，最优选为葡聚糖和/或葡聚糖衍生物。

18、本发明的一些具体的实施方式中，所述多糖为葡聚糖。

19、在本发明的一些实施方式中，所述供体颗粒在试剂3中的粒径分布变异系数c.v值不低于5％且不高于20％。在本发明的一些具体实施例中，所述供体颗粒在试剂3中的粒径分布变异系数c.v值选自5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％和20％。

20、在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括已知白介素6浓度的系列校准品溶液，所述系列校准品溶液中白介素6的浓度为0-5100pg/ml。

21、在本发明的一些实施方式中，所述系列校准品溶液中白介素6的浓度包括0、20、100、500、2000和5100pg/ml。

22、在本发明的另一些实施方式中，所述试剂盒还包括试剂2，所述试剂2包含与特异性结合配对成员中的一员连接的白介素6抗体，所述白介素6抗体能够与白介素6特异性结合。

23、在本发明的另一些实施方式中，所述试剂盒中含有至少1个试剂条，所述试剂条上开设有若干盛装试剂的试剂孔，其中至少3个试剂孔分别用于盛装所述试剂1、试剂2和试剂3。

24、本发明的第二方面提供了一种如本发明的第一方面所述的试剂盒在化学发光分析仪上的应用。

25、在本发明的一些实施方式中，所述应用包括如下步骤：

26、步骤s1，在盛液装置中分别加入待测样品、校准品和/或质控品；

27、步骤s2，向盛液装置中加入试剂1、试剂2和试剂3；

28、步骤s3，将盛液装置放入化学发光分析仪上进行反应和检测。

29、本专利的发明人研究发现，受体颗粒和供体颗粒的体积小，在试剂盒中的浓度低，制备工艺非常复杂，其质量容易受多种因素的影响，因此需要根据多次的检测实验来获得最佳的控制技术特征，比如受体颗粒和供体颗粒的粒径分布变异系数c.v值，由于受体颗粒和供体颗粒的体积内部要融入发光组合物或敏化剂，外部要包被抗体抗原或链霉亲和素，为了保证微粒的均一性，降低由微粒大小不均带来的误差，本领域技术人员通常会考虑将粒径分布变异系数c.v值控制在较小的数值范围，甚至越低越好。然而，本专利的发明人发现，如果想实现微粒的c.v值很小，对生产工艺的要求过高，极大地增加了试剂生产成本，不能形成产业化，使试剂无法在临床诊断中大量使用。尤其是包被了多糖之后，纳米微球的粒径分布变异系数c.v值的变化就更显著、更不稳定，难以满足医疗器械产品注册以及临床应用的试剂要求。但是，c.v值如果过大，光激化学发光检测的效果又不好。因此，本专利的发明人惊讶地发现，如果将受体颗粒和供体颗粒的粒径分布变异系数c.v值控制在一个合适范围内，能够获得最佳的光激化学发光检测结果，实现既有较合适的灵敏度，又有很宽的检测量程。

30、本发明的有益效果为：

31、将本发明提供的试剂盒在用于体外诊断主体是否患有心肌损伤中具有可行性，利用本发明提供的试剂盒以及相应的方法可以测定主体体液中il-6标志物的定量结果，还用于监测机体的免疫状态、炎症反应。本发明的试剂盒既有较合适的灵敏度，又有很宽的检测量程。