一种具有癌细胞富集功能的凝聚相材料的制备方法与应用

本发明涉及生物检测，具体涉及一种具有癌细胞富集功能的凝聚相材料的制备方法与应用。

背景技术：

1、癌症作为一种慢性疾病，其死亡率与施加干预的时期具有明显的相关性，部分癌症早期检测并治疗后的五年生存率已经超过90％，但总体上，癌症的早期检测效果不能令人满意，许多癌症检出时已经处于中晚期，治疗效果不佳。近年来，无论是公共卫生政策层面还是临床与基础研究层面，都对癌症的早期检测高度重视，癌症早期检测研究将是癌症研究的突破口和重点。

2、癌症早期时，癌细胞占正常细胞比例极低、检出信噪比低，因此难以检测。目前用于癌细胞检测的样品主要有组织细胞样品和血液样品两类。例如，宫颈癌多发生于女性子宫颈上皮，便于取组织细胞样品，在宫颈癌的巴氏涂片法检查中，需要有经验的细胞病理学家在数千细胞中辨认少量异常细胞，辨认难度大，漏检率高。对于结直肠癌等人体内部脏器的癌症，不易取组织细胞样品，则可取血液检测循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,ctcs)，但血液中含大量白细胞、红细胞，ctcs比例很低，检测也很困难。鉴于此，在检测之前，必须对癌细胞进行富集，才能实现低比例癌细胞的检测，进而提高癌症早期检测的能力。

3、目前已经有一些具备富集检测功能的技术，例如美国强生公司的系统，先用上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,epcam)抗体修饰磁性纳米粒子，再用免疫法将纳米粒子修饰在癌细胞表面，通过磁分选法富集癌细胞，最终使用免疫荧光法检测癌细胞。系统具备一定的适用性，但由于膜抗体局限性、流程复杂性在检测成功率、成本和适用癌细胞种类方面存在问题，推广受限。我国的tumorfishertm系统通过人工设计、合成、筛选的多肽替代了epcam抗体，用类似的原理实现了癌细胞检测，相比于系统，在检测成功率上做出改善，但仍面临较为繁琐的合成和富集检测流程。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种具有癌细胞富集功能的凝聚相材料的制备方法与应用，该凝聚相材料为宏观凝聚相材料，可以选择性富集癌细胞，从而有利于低浓度癌细胞的富集、标记和检测。当其用于癌细胞检测时，具有良好的灵敏性和准确性，可实现半定量分析，具有良好的临床应用前景。

2、为此，第一方面，本发明提供一种凝聚相材料，其由第一组分和第二组分组装得到；所述第一组分是一种能够结合癌细胞的分子，包括选自下组的至少一种：核黄素、腺嘌呤、鸟嘌呤、谷氨酸、谷氨酰胺、蝶酰谷氨酸、甲氨蝶呤、氨基喋呤、雷替曲塞；所述第二组分是一种阳离子聚合物，包括选自下组的至少一种：阳离子化改性纤维素、阳离子化改性甲壳素、阳离子化改性壳聚糖、支化聚乙烯亚胺、支化聚丙烯亚胺、聚二烯丙基二甲基氯化铵、聚2-(二甲胺基)甲基丙烯酸乙酯、聚2-(二乙胺基)甲基丙烯酸乙酯、聚2-(二乙胺基)丙烯酸乙酯。

3、在任意实施方式中，所述第一组分包括选自下组的至少一种：核黄素、谷氨酰胺、蝶酰谷氨酸、甲氨蝶呤、雷替曲塞；所述第二组分包括选自下组的至少一种：阳离子化改性纤维素、阳离子化改性甲壳素、阳离子化改性壳聚糖、支化聚乙烯亚胺、聚二烯丙基二甲基氯化铵。

4、在任意实施方式中，所述阳离子化改性纤维素包括选自下组中的至少一种：伯胺型阳离子化纤维素、叔胺型阳离子化纤维素、纤维素季铵盐。

5、在任意实施方式中，所述阳离子化改性甲壳素包括选自下组中的至少一种：伯胺型阳离子化甲壳素、叔胺型阳离子化甲壳素、甲壳素季铵盐。

6、在任意实施方式中，所述阳离子化改性壳聚糖包括选自下组中的至少一种：伯胺型阳离子化壳聚糖、叔胺型阳离子化壳聚糖、壳聚糖季铵盐。

7、在任意实施方式中，所述凝聚相材料由所述第一组分和所述第二组分在液液界面自组装得到。

8、在任意实施方式中，所述凝聚相材料的粒径为800～3200μm。

9、本发明的第二方面提供一种凝聚相材料的制备方法，包括：以滴加的方式将含有所述第一组分的溶液和含有所述第二组分的溶液混合，形成囊状结构的不溶物，经静置陈化后，即制备得到所述凝聚相材料。

10、在任意实施方式中，所述含有第一组分的溶液中，所述第一组分的浓度为7～15mg/ml。

11、在任意实施方式中，所述含有第一组分的溶液的ph值为6～9。

12、在任意实施方式中，所述含有第二组分的溶液中，所述第二组分的浓度为5～10mg/ml。

13、在任意实施方式中，所述静置陈化的时间为6h以上。

14、在任意实施方式中，所述静置陈化的温度条件为室温。

15、本发明的第三方面提供一种试剂盒，其包括本发明第一方面所述的凝聚相材料或者根据本发明第二方面所述的制备方法制备得到的凝聚相材料，以及第一标记物、第二标记物；

16、其中，所述第一标记物用于特异性识别癌细胞并且赋予所述癌细胞第一可检测标记；

17、所述第二标记物用于识别细胞并且赋予所述细胞第二可检测标记；所述第二标记物不与所述凝聚相材料发生结合。

18、在任意实施方式中，所述第一标记物包括特异性结合癌细胞标志物的第一抗体、特异性结合所述第一抗体的第二抗体，并且所述第二抗体修饰有第一可检测标记。

19、在任意实施方式中，所述癌细胞标志物包括选自下组的至少一种：p53、p63、p73、mdm-2、b23、c23、plap、ca125、muc-1、cerb/her2、ny-eso-1.scp1、ssx-1、ssx-2、ssx-4、hsp27、hsp60、hsp90、grp78、tag72、hoxa7、hoxb7、epcam、ras、间皮素、存活蛋白、egfk、muc-1和c-myc。

20、在任意实施方式中，所述第一可检测标记包括下组中的至少一种：化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料(例如af488、af555)、生物素、胶体金、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、乳胶颗粒。

21、在任意实施方式中，所述第二标记物为细胞核染料。

22、在任意实施方式中，所述细胞核染料包括下组中的至少一种：4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)、hoechst(例如hoechst 33258、hoechst 33342)。

23、本发明的第四方面，提供本发明第一方面所述的凝聚相材料、根据本发明第二方面所述的制备方法制备得到的凝聚相材料或者本发明第三方面所述的试剂盒在制备以下(i)、(ii)和/或(iii)所述产品中的用途：

24、(i)富集癌细胞的产品；

25、(ii)标记癌细胞的产品；

26、(iii)检测癌细胞的产品。

27、在任意实施方式中，所述癌细胞包括下组中的至少一种：肺癌细胞、尿道癌细胞、鳞状细胞癌细胞、垂体癌细胞、食管癌细胞、星形细胞瘤细胞、腹膜癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、宫颈癌细胞、卵巢癌细胞、膀胱癌细胞、乳腺癌细胞、结直肠癌细胞、子宫癌细胞、唾液腺癌细胞、肾癌细胞、前列腺癌细胞、外阴癌细胞、甲状腺癌细胞、脑癌细胞、睾丸癌细胞、胆管上皮癌细胞、胆囊癌细胞、胃癌细胞、头颈癌细胞。

28、在任意实施方式中，所述癌细胞包括下组中的至少一种：宫颈癌细胞、结直肠癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞。

29、与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：本发明提供的凝聚相材料为宏观尺度，不需要离心即可手动分离。该凝聚相材料对多种癌细胞均有主动富集能力，而正常细胞则无此现象，由于癌细胞富集至宏观材料，使得显微镜观察的检出率比未富集体系显著提高。本发明通过实验验证了该凝聚相材料具有广谱的癌细胞检测功能，具备优良的灵敏性和准确性，可实现半定量分析，具有良好的临床应用前景。