血浆中辛伐他汀的检测方法与流程

本发明涉及一种血浆中辛伐他汀的检测方法。

背景技术：

1、辛伐他汀为2,2-二甲基丁酸(4r,6r)-6-[2-[(1s,2s,6r,8s,8ar)-1,2,6,7,8,8a-六氢-8-羟基-2,6-二甲基-1-萘基]乙基]四氢-4-羟基-2h-吡喃-2-酮-8-酯；是一类新型降血脂的药物，结构中的六元内酯环在体内水解成开环羟基酸形式，即辛伐他汀酸后，才能呈现药理活性。开链的羟基酸结构部分竞争性抑制hmg-coa还原酶从而抑制内源性胆固醇的合成，降低对人体有害的低密度脂蛋白胆固醇、总胆固醇、甘油三酯，同时中等程度提高对人体有益的高密度脂蛋白胆固醇的血浆浓度。

2、研究表明，作为他汀类药物，辛伐他汀可通过降低极低密度脂蛋白胆固醇浓度、诱导低密度脂蛋白受体的生成而降低低密度脂蛋白，从而导致低密度脂蛋白胆固醇的产生减少、分解代谢增加。一般用于控制血液中胆固醇的含量以及预防心血管疾病。因此，对辛伐他汀的血药浓度检测也尤为重要。

3、近年来随着科研工作者对新药安全评价方法的深入研究，色谱法已经广泛应用于大量的小分子药物代谢检测中，方法开发过程中主要对所使用的溶剂和试剂、基质以及配制和处理步骤进行筛选，从而形成精确测定的方法。然而，辛伐他汀在血浆基质中极不稳定，甚至存于-80℃的超低温环境下也难以保证其稳定性，无疑对检测血浆中的真实浓度提出了挑战；且现有技术中大多采用液液萃取的方法，步骤复杂，操作不易。因此，辛伐他汀的检测方法的开发至关重要。

技术实现思路

1、为解决现有技术检测血浆中辛伐他汀浓度时所存在的真实性、准确度较差，操作复杂等缺陷，本发明提供了一种血浆中辛伐他汀的检测方法。相比之下，本发明检测方法中辛伐他汀在血浆中以更稳定的状态存在，检测结果更准确，检测步骤更简单。

2、为实现如上目的，本发明采用了如下技术方案：

3、本发明提供了一种血浆中辛伐他汀的检测方法，其包含如下步骤：标曲样品和待测样品预处理后，进行液相色谱-质谱联用法检测，建立标准曲线，计算浓度；其中，

4、所述标曲样品包括辛伐他汀标准品、稳定剂、“乙腈/醋酸-醋酸钠缓冲液”和空白血浆；所述待测样品包括稳定剂和待测血浆；

5、所述预处理包括：分别将所述标曲样品和所述待测样品与内标物工作液混合，离心取上清，以“乙腈/醋酸-醋酸钠缓冲液”稀释；

6、所述稳定剂为敌敌畏；所述内标物工作液包括内标物和蛋白沉淀剂。

7、本发明中，所述敌敌畏(2,2-dichlorovinyl dimethyl phosphate，ddvp)是有机磷化合物的一种，其化学名称为o,o-二甲基-o-(2,2-二氯乙烯基)磷酸酯，化学式为c4h7cl2o4p，其结构式如下：

8、

9、本发明中，所述空白血浆指未经任何处理、无辛伐他汀和内标物的空白血浆。所述空白血浆可为大鼠空白血浆或比格犬空白血浆，例如sd大鼠edta-k2空白血浆。

10、本发明中，所述“乙腈/醋酸-醋酸钠缓冲液”中乙腈和醋酸-醋酸钠缓冲液的体积比可为1:1。

11、本发明中，所述“乙腈/醋酸-醋酸钠缓冲液”中醋酸-醋酸钠缓冲液的ph可为3-6，较佳地为4.5。

12、本发明中，所述内标物可选自甲苯磺丁脲、双氯芬酸钠和拉贝洛尔中的任一种，较佳地为甲苯磺丁脲。

13、本发明中，所述蛋白沉淀剂可选自甲醇、乙腈和体积比为1:1的甲醇/乙腈中的任一种，较佳地为乙腈。

14、本发明中，所述检测方法还可包含如下步骤：

15、所述标曲样品的制备包括：辛伐他汀标曲工作液、稳定剂溶液和空白血浆混合；

16、所述待测样品的制备包括：稳定剂溶液和待测血浆混合；

17、其中，所述辛伐他汀标曲工作液包括辛伐他汀标准品、溶剂和“乙腈/醋酸-醋酸钠缓冲液”，所述稳定剂溶液包括稳定剂和溶剂。

18、较佳地，所述标曲样品的制备包括：所述稳定剂溶液和所述空白血浆混合后，再与所述辛伐他汀标曲工作液混合。

19、较佳地，所述辛伐他汀标曲工作液的制备包括：以所述溶剂溶解所述辛伐他汀标准品后，再以所述“乙腈和/醋酸-醋酸钠缓冲液”稀释。

20、较佳地，所述稳定剂溶液的制备包括：所述稳定剂和所述溶剂混合。

21、本发明中，所述内标物工作液还可包括溶剂；较佳地，所述内标物工作液的制备包括：以所述溶剂溶解所述内标物后，再以所述蛋白沉淀剂稀释。

22、本发明中，所述溶剂可各自独立地选自甲醇、乙腈、二甲基亚砜及其水溶液中的一种或多种；当所述溶剂为甲醇/水溶液时，所述甲醇和水的体积比可为1:1；当所述溶剂为乙腈/水溶液时，所述乙腈和水的体积比可为1:1；当所述溶剂为二甲基亚砜/水溶液时，所述二甲基亚砜和水的体积比可为1:1；较佳地，所述溶剂均为甲醇。

23、本发明中，所述稳定剂溶液中稳定剂的浓度可为1mg/ml；所述空白血浆和所述稳定剂溶液、所述待测血浆和所述稳定剂溶液的体积比均可为(1-20):1，较佳地为10:1。

24、本发明中，所述标曲样品中辛伐他汀标准品的系列浓度可为1、2.5、5、10、50、200、500和1000ng/ml。

25、本发明中，所述内标物工作液中内标物的浓度可为10-100ng/ml，较佳地为10ng/ml。

26、本发明中，所述标曲样品和所述内标物工作液、所述待测样品和所述内标物工作液的体积比均可为1:(1-20)，较佳地为1:4。

27、本发明中，所述液相色谱-质谱联用法中的液相色谱可按照本领域常规的操作步骤进行，较佳地为采用流动相a和流动相b进行梯度洗脱。

28、其中，所述流动相a可为含乙酸铵和甲酸的水溶液。

29、其中，所述流动相b可为极性有机溶剂。

30、所述流动相a和流动相b的选用可降低处理后的生物基质在辛伐他汀出峰位置的信号强度，同时提升辛伐他汀的峰信号，即提高信噪比，可进一步降低辛伐他汀的定量下限。

31、较佳地，所述流动相a中，所述乙酸铵的浓度较佳地为0.1-10mmol/l，例如5mmol/l，所述乙酸铵的浓度为1l水溶液中乙酸铵的摩尔数；所述甲酸的体积百分含量较佳地为0.05％-1％，例如0.1％，所述甲酸的体积百分含量为甲酸体积占水溶液体积的比例。

32、较佳地，所述极性有机溶剂为乙腈和/或甲醇，例如乙腈。

33、本发明中，所述液相色谱的色谱柱固定相可为十八烷基键合硅胶，例如beh c18，2.1×50mm，2.5μm。

34、本发明中，所述液相色谱的流速可为0.3-0.6ml/min，较佳地为0.5ml/min。

35、本发明中，所述液相色谱的柱温可为30-60℃，较佳地为40℃。

36、本发明中，所述梯度洗脱的过程中所述流动相a与所述流动相b的体积比随洗脱时间的变化可如下表所示：

37、

38、

39、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

40、本发明所用试剂和原料均市售可得。

41、本发明的积极进步效果在于：

42、本发明基于特定的标曲样品以及上样检测前的特定预处理步骤构建了血浆中辛伐他汀的检测方法，所构建的检测方法在满足方法学验证的相关要求的前提下，标准曲线线性更精准，检测的准确性和可靠性更高，可用于真实血浆中辛伐他汀含量的准确测定，具体如下：

43、1)本发明通过在血浆添加稳定剂后，可抑制血浆中的酶活性，提升辛伐他汀在血浆中的稳定性；

44、2)本发明以“乙腈/醋酸-醋酸钠缓冲液”制备标曲样品，同时以该溶液进行样品上样检测前的稀释处理，可进一步提升辛伐他汀在检测体系中的稳定性；

45、3)本发明的检测方法，以蛋白沉淀法进行上样检测前的预处理，该方法较常用的萃取的方法流程更为简单、用时短且易操作；

46、4)本发明的检测方法，样本进样量小、分析时间短、操作简单易操作，更有利于分析辛伐他汀在大鼠体中的药代/毒代动力学。