一种蛋白-细胞偶联物中的蛋白的检测试剂盒及其检测方法与流程

本发明属于生物，具体而言，涉及一种蛋白-细胞偶联物中的蛋白的检测试剂盒及其检测方法。

背景技术：

1、近年来，随着细胞治疗行业的深入发展，细胞治疗的产品丰富多样，其中细胞上偶联蛋白的产品越来越多，如白介素2-血小板偶联产物可用于治疗肾癌、黑色素瘤和非何杰金淋巴瘤等。为了实现细胞治疗的精准定量，比如精准定量蛋白-细胞偶联产品中的蛋白含量等等，这就需要大量能够满足这一要求的快速、方便、准确、灵敏的定量分析检测技术。

2、目前关于细胞上偶联的蛋白的定量，elisa和流式的技术尚无法对细胞上偶联的蛋白进行比较准确的定量。因此，目前还需要开发可快速、高效和准确的检测蛋白-细胞偶联物中的蛋白含量的方法。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种蛋白-细胞偶联物中的蛋白的检测试剂盒及其检测方法，通过采用耐高温胰蛋白酶smart digest对待测样品进行酶解，并优化了酶解和分析检测过程的工艺参数，使蛋白在酶解过程中发生变性，省去了常规肽图样品的变性、萃取、变性、萃取、干燥、复溶等前处理步骤，缩短了酶切时间，优化液相梯度，降低了液相色谱串联质谱检测的基质效应，显著提高了检测精密度和准确度。

2、一方面，本发明提供了一种定量检测蛋白偶联物中的蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括耐高温胰蛋白酶、酶解缓冲液、酶解终止液，所述耐高温胰蛋白酶的酶解温度为70℃以上；所述蛋白偶联物为蛋白与细胞、抗体、抗原、或核酸偶联的产物。

3、为了能够定量检测蛋白偶联物中的蛋白，首先必须通过肽图分析，在蛋白偶联物中，找到仅存在于目标蛋白(待测蛋白)中，不存在于偶联载体中，且不参与偶联，响应值高的极性适中的肽段作为目标肽段，然后再通过对目标肽段的含量进行分析来实现蛋白偶联物中的蛋白定量。

4、为获得理想的肽图谱，通常在进行特异性裂解(如酶解)之前或之后，需要对待测蛋白质样品进行预处理。如样品中存在干扰成分、载体蛋白、赋形剂、稳定剂等，还需进行必要的浓缩、分离和纯化。对于复杂的大分子蛋白，其高级结构形成的空间位阻可能阻碍裂解剂到达裂解位点发挥作用，需要进行必要的变性剂处理、二硫键还原以及随后的游离巯基烷基化保护等；单克隆抗体、多亚基糖蛋白以及其他异源多聚体蛋白等蛋白质，裂解处理前可能需要分离重链和轻链、不同亚基，甚至去除糖侧链；在进行上述预处理步骤之后，还应采取必要的步骤去除预处理过程中引入的变性剂、还原剂、酰化试剂等其他试剂。必要时还需验证经过预处理后待测蛋白质的完整性和/或回收率。

5、可见常规肽图样品的制备过程非常繁琐，包括变性、萃取、干燥、复溶、烷基化、换液等等复杂步骤，而且因为换液等步骤操作繁琐复杂，会导致方法精密度和准确度差等问题。因此通过现有方法来检测定量检测蛋白偶联物中的蛋白步骤复杂，非常耗费人力物力。

6、本发明经大量研究惊喜地发现，通过采用耐高温胰蛋白酶对待测样本进行高温酶解后，只需离心取上清就可以进行肽图分析，根本无需进行其他任何前处理。其原因可能是耐高温胰蛋白酶对待测样本进行高温(70℃以上)酶解和高速离心后，疏水性肽段和杂质都会沉淀，仅剩其中的部分极性适中的肽段留存在离心后的上清液中，只要能够找到仅存在于目标蛋白中，不存在于偶联载体中，且不参与偶联，响应值高的极性适中的肽段作为目标肽段，就能非常简单轻松地实现蛋白偶联物中的蛋白的定量检测。

7、所述极性适中的肽段是指能在梯度的20％-80％之间，在c18色谱柱上出峰，在高温酶解过程中不会发生沉淀的肽段。极性强的肽段会因为极性强导致在色谱柱上弱保留甚至不出峰，极性太弱的肽段会因为极性太弱容易在检测过程中或者高速离心的条件下发生沉淀。

8、所述偶联载体是指能与蛋白发生偶联的细胞、抗体、抗原、核酸和小分子等等，偶联载体通过共价键、氢键、盐桥、范德华力、亲和力、免疫结合等等方式与蛋白结合在一起的产物即为蛋白偶联物。本发明提供的方法和试剂盒适用于任何蛋白偶联物，只要能够找到仅存在于目标蛋白中，不参与偶联，响应值高的极性适中的肽段，就能够通过该方法定量检测蛋白偶联物中的蛋白。

9、另外，常规的胰蛋白酶酶切时间通常需要4～18h，酶切时间长会导致肽段上发生翻译后修饰等，降低方法准确度；本发明采用耐高温胰蛋白酶的酶切时间短，仅需1h，有助于提高检测结果的准确性。

10、进一步地，所述蛋白偶联物为蛋白与细胞偶联的产物；所述耐高温胰蛋白酶为smart digest胰蛋白酶。

11、所述smart digest胰蛋白酶试剂盒为购自thermo fisher，货号60113-101的耐高温胰蛋白酶试剂盒，内含酶解缓冲液和胰蛋白酶。可以理解的是，任何耐高温的、专属性强(酶切赖氨酸c末端，酶切位点专一)的蛋白酶都可以用于本发明提供的方法和试剂盒来实现蛋白偶联物中的蛋白的定量检测。

12、进一步地，所述蛋白-细胞偶联产物为白介素2-血小板偶联产物。

13、进一步地，所述酶解终止液为甲酸溶液；所述试剂盒还包括液相色谱流动相，流动相a为0.1％甲酸水溶液，流动相b为0.1％甲酸乙腈溶液。

14、为了使不同样品间的一致性更好，在特定温度下酶解一定时间后，需要通过添加酶解终止液来终止酶解反应。

15、另一方面，本发明提供了一种定量检测蛋白-细胞偶联物中的蛋白的方法，采用如上所述试剂盒进行检测，包括如下步骤：

16、(1)利用smart digest胰蛋白酶对目标蛋白-linker和空白细胞进行高温酶解，离心后取上清，再通过液相色谱串联质谱进行肽图分析，找到仅存在于目标蛋白，且不与细胞偶联的系列肽段；所述高温酶解的温度为70℃以上；

17、(2)合成步骤(1)确定的系列极性适中肽段，在液相色谱串联质谱上选择响应较高的肽段作为目标肽段；

18、(3)采用同位素c13和n15合成步骤(2)中的目标肽段作为检测时的同位素内标；

19、(4)利用smart digest胰蛋白酶对待测样品进行高温酶解，通过同位素内标校正质谱仪器的偏差，分析其中的目标肽段含量，再根据标准曲线计算目标蛋白的含量；所述高温酶解的温度为70℃以上。

20、进一步地，所述smart digest胰蛋白酶进行酶解的方法为：在样品中加入smartdigest胰蛋白酶和酶解缓冲液进行酶解反应，酶解后加入酶解终止液终止反应；酶解终止液为甲酸溶液。

21、进一步地，所述酶解的温度为70℃，酶解时间为1小时。

22、当酶解温度为70℃，目标肽段检测结果的响应度更高，其原因可能是在该温度下蛋白变性的效果更好，所以酶切效率也更高。

23、进一步地，步骤(1)所述的液相色谱串联质谱进行肽图分析，采用的液相色谱流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a为0.1％甲酸水溶液，流动相b为0.1％甲酸乙腈溶液，流速为0.3ml/min，梯度洗脱程序为：

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26、虽然最后酶解样品中含有很多的细胞自身的蛋白的酶解肽段，但是利用液相和c18色谱柱对其进行分离，这降低了大部分基质效应；同时本发明通过筛选流动相，优化梯度洗脱程序，肽图分析时各肽段的分离效果更好，降低基质效应，检测结果更加精准。

27、再一方面，本发明提供了一种序列用于制备白介素2-血小板偶联产物中的白介素2含量检测的目标肽段的用途，所述序列具有如seq id no.1所示的氨基酸序列。

28、本发明找到一条序列t7可用于白介素2-血小板偶联产物中的白介素2的含量检测，t7具有如seq id no.1所示的氨基酸序列。t7序列仅存在于目标蛋白白介素2中，不存在于血小板中，也不参与偶联，而且响应值高，为极性适中的肽段，最适合用于白介素2-血小板偶联产物中的白介素2的含量检测。

29、再一方面，本发明提供了一种耐高温胰蛋白酶用于制备蛋白偶联物中的蛋白的检测试剂的用途，所述耐高温胰蛋白酶为smart digest胰蛋白酶，酶解温度为70℃以上。

30、本发明具有以下有益效果：

31、(1)通过采用耐高温胰蛋白酶smart digest对待测样品进行酶解，省去了常规肽图样品制备中的变性、萃取、干燥、复溶、烷基化、换液等复杂步骤，操作简单，耗时短，检测结果线性好，精密度高；

32、(2)酶切时间短，仅需1h，有助于提高检测结果的准确性；而常规的胰蛋白酶酶切时间通常需要4～18h，酶切时间长会导致肽段上发生翻译后修饰等，降低方法准确度；

33、(3)通过筛选流动相，优化梯度洗脱程序，使肽段与其他基质杂质最大限度的分离，降低基质效应，检测结果更加精准；

34、(4)在0.6-7.2μg蛋白/108个细胞水平上，获得优异的线性相关系数，r2>0.995。