低水平冻干态糖化血红蛋白质控品及其制备方法与流程

本发明涉及血液检测，具体涉及低水平冻干态糖化血红蛋白质控品及其制备方法。

背景技术：

1、人体血液中正常血红蛋白（hb）有三种血红蛋白亚组分组成：血红蛋白a（hba）、血红蛋白f（hbf）和血红蛋白a2（hba2）。成人血红蛋白中主要含有血红蛋白a（hba），其又由两种亚组分组成：糖化血红蛋白（hba1）（5%-7%）和非糖化血红蛋白（hba0）（90%）。糖化血红蛋白（hba1）也有三种亚组分，分别为：hba1a、hba1b和hba1c。其中，hba1c约占hba1的75%-80%，且结构稳定，能反应测定前两到三个月的平均血糖水平。因此被用作糖尿病控制的监测指标。且受抽血时间、患者是否空腹、是否使用胰岛素等因素干扰小。

2、目前，临床实验室中应用的糖化血红蛋白检测方法主要有高效液相色谱法、电泳法、亲和层析法和免疫法等。其中，高效液相离子层析法（hplc）被公认为金标准。

3、质控品是一类在临床检验工作中广泛应用的物质，其作用是评估体外诊断设备及试剂的性能是否符合原先设置的标准。临床检验中要求糖化血红蛋白质控品必须覆盖正常测试范围及异常测试范围。对于正常人的测试结果一般在4%-6%，高血糖和糖尿病病人的测试结果一般在6%-16%，因此，糖化血红蛋白质控品大部分生产厂家通常会提供两个水平的质控品，低水平质控品（4%-6%）和高水平质控品（8%-10%），但是所谓的低水平质控品是落在了正常值参考范围内的质控品，并非真正的低水平范围（2%-4%）的质控品，目前在低于正常范围的商业化质控品较少，对于检出限的检测没有衡量的标准，为促进整个检测范围的质量标准控制，需制备低于正常范围的质控品。

4、糖化血红蛋白质控品的制备多以人全血或猪血或猪血红蛋白为原料，经过离心、洗涤、破碎细胞，去除杂质及冻干等多个步骤制成。首先，对血液样本进行离心处理，获得红细胞。利用洗涤液对所述红细胞进行洗涤，形成红细胞悬液。在洗涤后的红细胞加入反应液进行糖基化或进行亲和层析获取高糖基化血红蛋白溶液，再通过纯化、混合、离心等操作配制不同水平的质控品。最后在处理好的红细胞悬液中加入稳定剂、冻干保护剂，制成液体或冻干的糖化血红蛋白质控物。

5、综上，虽然制备糖化血红蛋白质控品的方法各有不同，但，低水平糖化血红蛋白质控品hba1c测定值多在4%-6%之间，且需要有配套试剂或配套仪器才可用于质量控制，不能满足参考值下限4%范围外的质控测试要求。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供低水平冻干态糖化血红蛋白质控品及其制备方法，本发明提供的低水平冻干态糖化血红蛋白质控品稳定性高，制备方法简单且原料方便易获取，可满足正常参考值下限范围外的质控测试要求。

2、本发明提供了制备低水平糖化血红蛋白质控品的试剂组合，包括溶血剂和冻干保护剂；

3、所述溶血剂包括磷酸盐缓冲液、叠氮化钠和表面活性剂，所述表面活性剂包括曲拉通、脱氧胆酸钠和sds中的至少一种；

4、所述冻干保护剂包括nacl、bsa、tween-80、dtt、葡萄糖、海藻糖、乳糖、vc、tris-hcl、hepes和甘氨酸中的至少一种。

5、与其他试剂组合相比，本发明提供的试剂组合为低水平糖化血红蛋白质控品的制备提供了更加有效的溶血效果以及更稳定的冻干体系，能够更大程度的保证冻干后血红蛋白质控品的稳定性、灵敏度和特异性，从而获得更准确的技术效果。

6、在一些实施例中，所述溶血剂包括磷酸盐缓冲液、叠氮化钠和曲拉通，所述磷酸盐缓冲液包括磷酸二氢钠和磷酸氢二钠；

7、所述冻干保护剂包括nacl、bsa、tween-80、海藻糖、hepes和甘氨酸。

8、相比较其他试剂，上述各组分之间相互配合紧密，兼容性强，能够更有效的配合血红蛋白质控品的制备，从而获得更准确的技术效果。

9、在一些实施例中，所述溶血剂包括0.5~3mmol/l磷酸盐缓冲液、0.5~1.5mmol/l叠氮化钠和0.2~1.0mmol/l曲拉通；

10、所述冻干保护剂包括0.1~0.3mol/l nacl、2wt%~5wt% bsa、0.1wt‰~0.2wt‰tween-80、2wt%~5wt%海藻糖、20~100mmol/l hepes和2wt%~5wt%甘氨酸。

11、在一些具体实施例中，所述溶血剂包括0.4mmol/l曲拉通，1.0mmol/l磷酸二氢钠、2.5mmol/l磷酸氢二钠和0.5mmol/l叠氮化钠；

12、所述冻干保护剂包括0.15mol/l nacl、2wt%bsa、0.1wt‰tween-80、5wt%海藻糖、60mmol/l hepes和4wt%甘氨酸。

13、实验表明，在此浓度下，所述试剂组合配合血红蛋白质控品的制备效果最佳。

14、本发明提供了低水平糖化血红蛋白质控品的制备方法，包括如下步骤：

15、步骤1：取正常血液样本，经离心、去除血浆和血小板后的获得的溶液，经pbs缓冲液清洗、离心、去除上清后获得红细胞悬液；

16、步骤2：所述红细胞悬液与所述的试剂组合中的所述溶血剂混合，经离心、去除沉淀后获得血红蛋白溶液；

17、步骤3：所述血红蛋白溶液与所述的试剂组合中的所述冻干保护剂混合后，获得所述低水平糖化血红蛋白质控品。

18、在一些实施例中，所述血液样本包括人血样本和猪血样本；

19、所述步骤1中所述红细胞悬液包括人红细胞悬液和猪红细胞悬液，；

20、所述步骤2中所述血红蛋白溶液包括人血红蛋白溶液和猪血红蛋白溶液；

21、所述步骤3中，所述血红蛋白溶液中包括体积比为1：（0.1~10）的人血红蛋白溶液和猪血红蛋白溶液。

22、实验表明，牛血样本和牛血红蛋白与人血液样本的出峰时间及目标蛋白的差异性较大，不能真实反应临床样本的检测结果，在质控分析和使用中不能作为产品稳定性的控制物质。从出峰个数与总峰面积来看，人血红蛋白、猪血红蛋白和牛血红蛋白配置的出峰个数较相应的血液样本少，峰面积较低，目标蛋白处峰面积小，因此选择人血样本和猪血样本进行混合测试能够更有效的实现低水平糖化血红蛋白质控品的制备，从而获得更准确的技术效果。

23、进一步地，所述人血红蛋白溶液和猪血红蛋白溶液中血红蛋白的浓度均为0.1~0.2g/ml，所述人血红蛋白溶液检测ngsp糖化血红蛋白hba1c结果为4%-6%，所述猪血红蛋白溶液检测ngsp结果为1%-3%。

24、更进一步地，所述步骤1中，所述离心的条件为：2000~4000 rpm/min离心10~20min，所述溶液与所述pbs缓冲液的体积比为1:（1~5），所述清洗的次数为2~5次；

25、所述步骤2中，所述红细胞悬液与所述溶血剂的体积比为1：（0.5~2）；

26、所述步骤3中，所述血红蛋白溶液与所述冻干保护剂的体积比为1：（1~5）。

27、在一些实施例中，所述人血样本和所述猪血样本在采集时需要使用到抗凝剂，以防止采集的血液将很快凝成固体，不能用于后续离心处理等工序。所述抗凝剂包括edta、枸橼酸钠和肝素中的至少一种。

28、在另一些实施例中，还包括冻干的步骤，所述冻干包括取所述低水平糖化血红蛋白质控品，经真空冷冻干燥获得冻干态的所述低水平糖化血红蛋白质控品。

29、本发明提供了所述的制备方法制得的低水平糖化血红蛋白质控品。

30、本发明还提供了所述的制备方法制得的低水平糖化血红蛋白质控品在制备糖化血红蛋白检测试剂或试剂盒中的应用。

31、本发明提供了包括溶血剂和冻干保护剂的试剂组合以及采用所述试剂组合制备的低水平糖化血红蛋白质控品，本发明还提供了所述低水平糖化血红蛋白质控品的制备方法及其应用。本发明提供的低水平冻干态糖化血红蛋白质控品稳定性高，以正常人红细胞和猪血红蛋白或新鲜猪血为原料，原料方便易获取，并可涵盖医学决定水平处低值范围外的测试需求，同时制备方法简单，可进行批量工业化生产。本发明提供的低水平冻干态糖化血红蛋白质控品在2~8℃存放可稳定保存2年，开瓶复溶后2~8℃存放可稳定15天，-20℃存放可稳定60天。