用于双唑草腈及其代谢物M-1和PM-5的检测方法与流程

本发明涉及双唑草腈检测，特别是涉及用于双唑草腈及其代谢物m-1和pm-5的检测方法。

背景技术：

1、双唑草腈(prochloraz)是一种双吡唑类触杀型除草剂，属原卟啉氧化酶(ppo)抑制剂，其作用机理主要是通过抑制植物体内ppo活性，使原卟啉原ix无法氧化生成原卟啉ix,叶绿素合成受阻，从而导致植物死亡达到除草目的。gb2763-2021《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》规定水稻稻谷和糙米中双唑草腈的临时最大残留量为0.3mg/kg，双唑草腈的监测定义为双唑草腈，膳食风险评估定义为：双唑草腈、m-1：双唑草腈n-甲基体：1-(3-氯-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-5-甲氨基-1h-吡唑-4-腈、pm-5：1-(3-氯-4-羟基-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-5-甲氨基-1h-吡唑-4-腈之和，以双唑草腈表示。双唑草腈、m-1和pm-5的结构式，如式1-式3所示。

2、

3、

4、gb2763-2021《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中暂未推荐检测方法。目前已有文献用质谱检测双唑草腈母体在虾和土壤中的残留，但很少有关于双唑草腈代谢物m-1和pm-5在水稻上的检测方法，因此我们尝试建立此种方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供用于双唑草腈及其代谢物m-1和pm-5的检测方法，能同时检测双唑草腈、代谢物m-1和pm-5，填补了现有技术中此部分的空缺，还对条件进一步优化，提供了较佳的uplc-ms/ms选择条件。

2、用于双唑草腈及其代谢物m-1和pm-5的检测方法，，代谢物包括m-1和pm-5，所述m-1为双唑草腈n-甲基体，所述pm-5为1-(3-氯-4-羟基-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-5-甲氨基-1h-吡唑-4-腈，测定包括以下步骤：

3、提取：称取水稻样品，所述水稻样品为水稻糙米、稻壳和秸秆，在所述水稻样品中分别加入溶剂混匀，再加入乙腈和氯化钠，超声提取，机械振荡，离心，得到待净化的离心样品；

4、净化：移取所述离心样品的上清液，转移至装有psa和无水硫酸镁的离心管中，涡旋，离心，取上清液过有机滤膜，得到水稻糙米基质液、稻壳基质液和秸秆基质液；

5、标准溶液配制：称取双唑草腈标准品，溶解并定容，配制成母液c；称取m-1标准品，溶解并定容，配制成母液d；称取pm-5标准品，溶解并定容，配制成母液e；用乙腈稀释，配制混合标准工作溶液，再用乙腈提取的空白溶剂和所述水稻糙米基质液、稻壳基质液以及秸秆基质液进行稀释并配制成浓度分别为0.1、0.04、0.02、0.004、0.001mg/l的系列标准溶液；

6、绘制标准曲线：分别将配制的所述系列标准溶液用液相色谱串联质谱仪按照浓度从低到高的顺序进行检测，每个浓度重复多次，以溶液浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，制作双唑草腈标准曲线、m-1标准曲线和pm-5标准曲线；

7、添加回收率试验：称取水稻空白样品，所述水稻空白样品为水稻糙米、稻壳和秸秆，分别置于离心管中，分别都加入所述母液c、所述母液d、所述母液e，配制成0.02、0.2、0.3mg/kg三种添加水平的加标溶液，共27种样品，添加后进行振荡充分混匀，静置，得到静置后的样品，将所述静置后的样品，加入溶剂混匀，再加入乙腈和氯化钠，超声提取，机械振荡，离心，移取上清液，转移至装有psa和无水硫酸镁的离心管中，涡旋，离心，取上清液过有机滤膜，得到待液相色谱串联质谱仪测定的滤液a，将所述滤液a放入液相色谱串联质谱仪中分析检测，计算添加回收率和相对标准偏差。

8、优选的，所述液相色谱串联质谱仪的检测条件包括液相色谱条件和质谱条件，所述液相色谱条件如下：

9、流速为0.3ml/min；流动相a为甲酸水溶液和乙酸铵的混合液，流动相b为乙腈；柱箱温度为35℃；进样量为10μl；

10、梯度：0～0.5min：90％b；0.5～2.0min：10-90％b；2.0～4.0min：90％b；4.0-4.1min：90-10％b；4.1～5min：10％。

11、优选的，所述质谱条件如下：

12、电离源模式为esi；电离源极性为正；毛细管电压3.2kv；离子源温度120℃；脱溶剂气温度450℃；雾化气气体及流量：n2，650l/hr；cid气类型及气压：ar，0.28ml/min。

13、优选的，所述质谱条件还包括如下：

14、

15、优选的，在提取中，超声提取3～10min，机械震荡20～60min，2000～5000r/min离心3～10min。

16、优选的，在净化中，涡旋10～50s，8000～10000r/min离心5～10min。

17、优选的，所述有机滤膜的孔径为0.10～0.22μm。

18、优选的，在添加回收率试验中，超声提取3～10min，机械震荡20～60min，2000～5000r/min离心3～10min。

19、优选的，所述双唑草腈n-甲基体为1-(3-氯-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-5-甲氨基-1h-吡唑-4-腈，所述溶剂包括纯水、乙腈、甲醇、丙酮中的至少一种。

20、本发明的有益效果是：

21、本技术建立了一种用于双唑草腈及其代谢物m-1和pm-5的检测方法，能同时检测双唑草腈、代谢物m-1和pm-5，填补了现有技术中此部分的空缺。双唑草腈及其代谢物m-1和pm-5在水稻各基质中的平均回收率为72％～95％，相对标准偏差为0.0％～4.7％。添加回收试验的结果表明此分析方法的灵敏度和精确性均符合农作物中农药残留试验准则(ny/t788-2018)中对添加回收试验的要求。本技术的方法操作简单方便、高效准确，适用于膳食风险评估定义水稻中双唑草腈总量(双唑草腈、m-1和pm-5之和，以双唑草腈表示)的检测。

22、本技术还对条件进一步优化，提供了较佳的uplc-ms/ms选择条件，包括(1)质谱条件的选择，esi源正离子溶剂效应和基质干扰较小；(2)液相条件的选择，不同流动相对pms-5峰型和响应影响较大，乙腈-0.1％甲酸水溶液(含5mmol/l乙酸铵)为流动相，使用流动相梯度时(0～0.5min90％为乙腈，0.5～2.0min为10-90％乙腈；2.0～4.0min为90％乙腈，4.0-4.1min：90-10％乙腈，4.1～5min：10％乙腈)，双唑草腈及其代谢物m-1和pm-5响应较高并且分离度更好；(3)净化条件的选择，50mgpsa+50mgmgso4做净化剂时，可同时使水稻糙米、稻壳和秸秆中双唑草腈及代谢物m-1和pm-5的结果符合要求。本技术还进一步发现加酸或氨水影响会代谢物的灵敏度和回收，乙腈做提取剂时，可同时保证双唑草腈及代谢物m-1和pm-5的灵敏度和回收率要求。