一种基于血管灌注的硬组织切片的制备方法和应用与流程

本发明属于骨组织工程，具体涉及一种基于血管灌注的硬组织切片的制备方法和应用。

背景技术：

1、骨是一种高度血管化的组织，其再生过程需要成骨和血管化的协同作用。近年来，血管在骨缺损修复、骨移植物成活过程中的作用也成为国内外学者研究的热点。因此，对骨内血管化水平进行精确检测尤为重要。

2、目前检测骨内微血管的方法主要有：血管灌注、墨汁染色、microct扫描重建、硬组织切片vg染色、石蜡切片h-e染色、masson染色、免疫组织化学、weigert氏间苯二酚品红染色等。microct扫描重建可以三维重构骨内血管的结构，但其重建过程因人而异，尚无统一标准，而且该方法对血管的细节显示不足；常规组织学方法可以显示血管的数目和管径大小，但并不能对血管的整体结构及形态进行检测。

3、血管化过程在骨折愈合、骨缺损修复及移植骨成活等方面有着至关重要的作用，股骨头坏死、骨梗死、骨不连等一些骨科疾病也与血管功能减退有着密切关系。组织学切片的方法是检测骨内血管化的常规手段，通过h-e、masson、vg、weigert氏间苯二酚品红等染色方法，可以显示血管的断面形态甚至血管内皮细胞。但该类方法尚存在如下的缺陷：

4、(1)以上的切片方法层厚要求较薄，仅仅能够显示单个剖面的血管情况；

5、(2)各种染料其染色原理类似，大多数为酸碱亲和性结合，并不能特异性区分微血管与其他组织；

6、(3)血液流失后，血管失去其功能形态，脱水、制片过程进一步加剧其塌陷、扭曲和折叠。

7、因此，亟待探索出一种基于血管灌注及硬组织切片技术的骨微血管研究方法，以实现能够清晰地显示骨内微血管的形态结构及与骨组织之间的关系，同时对血管参数进行较为精确的检测。

技术实现思路

1、基于现有技术存在的缺陷，本发明的第一目的在于提供一种基于血管灌注的硬组织切片的制备方法，本发明的第二目的在于提供该制备方法制备获得的硬组织切片；本发明的第三目的在于提供该硬组织切片在植骨材料内部血管化研究中的应用。

2、本发明的目的通过以下技术方案得以实现：

3、一方面，本发明提供一种基于血管灌注的硬组织切片的制备方法，其包括如下步骤：

4、步骤一，制备血管灌注骨标本并固定；

5、步骤二，将血管灌注骨标本进行脱水和透明；

6、步骤三，将血管灌注骨标本进行渗透和包埋；

7、步骤四，将血管灌注骨标本进行修块和切片；

8、步骤五，将血管灌注骨标本进行打磨抛光；

9、经过上述5个步骤，获得基于血管灌注的硬组织切片。

10、上述的制备方法中，优选地，所述步骤一的具体步骤包括：

11、选取7～8个月的新西兰大白兔，采用陆眠宁复合戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉；仰卧位，腹部正中切口，分离腹主动脉及静脉，经由腹主动脉端灌注，静脉端回流灌注液；

12、灌注结束后过量麻醉处死动物，于4℃过夜后取兔股骨下段标本；

13、将标本先用生理盐水冲洗除去杂质，然后置于多聚甲醛溶液中固定，制备得到血管灌注骨标本。

14、上述的制备方法中，优选地，所述戊巴比妥钠的注射剂量为30mg/kg。

15、上述的制备方法中，优选地，所述陆眠宁的注射剂量为0.5ml/kg。

16、上述的制备方法中，优选地，所述多聚甲醛溶液的质量浓度为4％。

17、上述的制备方法中，优选地，静脉端回流灌注液按以下顺序依次进行灌注：(1)肝素化生理盐水(100u/l)1000ml，灌注速度45mi/min；(2)10％中性甲醛固定液300ml，灌注速度25ml/min；(3)microfl1-mv117溶液50ml，灌注速度10ml/min。

18、上述的制备方法中，优选地，所述步骤二的具体步骤包括：

19、将血管灌注骨标本经多聚甲醛固定1周后，流水冲洗样品24h，并依次用70％、80％、85％、90％、95％、100％、100％的乙醇脱水各24h；接着采用二甲苯透明24h。

20、上述的制备方法中，优选地，所述乙醇、所述二甲苯的体积用量为标本体积用量的20倍以上。

21、上述的制备方法中，优选地，所述步骤三的具体步骤包括：

22、二甲苯透明后的标本在渗透液i、ii、iii中分别浸泡24h，之后将样品按一定方向放入包埋瓶中小心倒入包埋液；

23、包埋时，将样品编号，再放入平底玻璃瓶中，加入包埋液，移入真空干燥箱中抽真空干燥4h，随后置于36.5℃中水浴聚合24～48h，最后放入37℃恒温箱中聚合12～24h。

24、上述的制备方法中，优选地，所述渗透液i是由400ml的甲基丙烯酸甲酯、100ml的邻苯二甲酸二丁酯、500ml的二甲苯混合组成。

25、上述的制备方法中，优选地，所述渗透液ii是由800ml的甲基丙烯酸甲酯、200ml的邻苯二甲酸二甲酯混合组成。

26、上述的制备方法中，优选地，所述渗透液iii是由800ml的甲基丙烯酸甲酯、20g的过氧化苯甲酰、200ml的邻苯二甲酸二丁酯混合组成。

27、上述的制备方法中，优选地，所述包埋液是800ml的甲基丙烯酸甲酯、60g的过氧化苯甲酰、200ml的邻苯二甲酸甲酯。

28、上述的制备方法中，优选地，所述步骤四的具体步骤包括：

29、将包埋的组织标本在4℃冰箱放置一周后，取出包埋标本；

30、将标本固定在内沿切割机上，选定一个初切断面，修块至切面平整；

31、采用leica 1600型锯式切片机调整切片厚度为350μm，所得切片以502胶水黏贴于载玻片轻压除去气泡，然后于室温下放置12h待胶水完全凝固。

32、上述的制备方法中，优选地，所述步骤五的具体步骤包括：

33、以细砂纸手工打磨切片表面至平整，添加抛光粉抛光，显微镜下观察切片表面无划痕即为抛光完成，得到硬组织切片。

34、上述的制备方法中，优选地，所述抛光粉包括三氧化二铝，其颗粒直径为1～10μm。

35、另一方面，本发明还提供一种基于血管灌注的硬组织切片，其是采用上述的制备方法制备得到的。

36、再一方面，本发明还提供上述的基于血管灌注的硬组织切片在植骨材料内部血管化研究中的应用。

37、本发明探索出一种骨内微血管研究的新方法并验证其可靠性。该方法主要包括3个关键技术，即血管灌注、厚硬组织切片制备以及绿色荧光背景成像。

38、在活体状态下对血管进行灌注可以避免血液流失造成的血管塌陷及形态改变。通过连续灌注的方法对血管进行冲洗，置换其内血液，然后灌注10％中性甲醛对血管网络进行固定。microfil1 mv-117灌注液是一种可注射性硅橡胶在固化剂的作用下，能够短时间内凝固。利用该灌注液对血管进行充分灌注，并在4℃过夜，可以使血管固定于充盈状态，真实还原血管的功能形态。在实验过程中测量骨内血管的平均管径大小为100～200μm，而石蜡切片其厚度一般在4～7μm，普通塑料包埋硬组织切片其厚度小于100μm，因此普通的制片方法只能在单一剖面显示血管，而不显示血管的结构全貌。

39、本发明的方法制备厚度约为300μm的硬组织切片，能够保存大部分血管的结构形态，但由于厚度较厚，在显微镜白场下观察时并不能很好地区分血管、骨组织及骨髓成分，因此本方法采用荧光背景对硬组织切片进行显像。在单一蓝色光激发下，骨组织为黄绿色，骨小梁结构清晰可见，同时灌注橘红色microf11试剂的血管在此背景下呈现出与真实血管相似的鲜红色。对微血管的最小直径测量结果表明，该方法可以充分显示毛细血管级别的骨内微血管网络。

40、本发明的有益效果：

41、本发明的方法相比较常规切片方法能够特异性还原骨内微血管的功能状态，组织辨识度高，血管灌注充分，可以显示毛细血管级别微血管网络。同时由于采用硬组织切片制备技术，因此该方法可以用于各种植骨材料(包括金属)内部血管化的研究。

42、上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。