一种高通量高内涵的药物筛选方法

本发明涉及药物筛选，具体是一种高通量高内涵的药物筛选方法。

背景技术：

1、发现和筛选有效的候选药物一直是科学界和制药界的最终目标。然而，对于一种候选药物，在进入临床试验前，就需要通过大量的细胞实验确定其剂量-反应关系、毒性、副作用和药理作用等，这是一个昂贵、耗时和费力的过程。此外，当一些新兴疾病迅速传播和发展时，我们需要尽可能迅速地筛选大量候选药物，并且得到尽可能多的药物用作信息，以将经济和健康损失降到最低。因此，时间成本、通量和内涵丰富度是优化筛药方法的主要考虑因素。

2、传统的药物筛选多是在多孔板中完成的，这种方法不仅通量低，对试剂的消耗量还很大。面对庞大的潜在药物体系，需要付出的研究成本非常高。微坑阵列通过注塑成型、软光刻等工艺将大量微小的细胞培养单元集成在一张芯片上，其小型化和高集成度的特点不仅大大提高了检测通量，还减少了试剂消耗。因此，这种制备成本低、检测通量高的微坑阵列芯片已经广泛地应用于药物筛选研究中。

3、使用微坑阵列芯片进行高通量的药物筛选时必须保证微坑之间不能发生交叉污染。目前，能较好的满足上述要求的是申请号为201610232372.6的文献公开了一种超疏水微坑阵列芯片及其制备方法与应用，其提供了两种超疏水微坑阵列芯片的制备方法。第一种是基于pdms制备的，该方法将pdms预聚物注入到硅模具中，固化后翻模得到pdms微坑芯片。通过在微坑表面附着一层3140康宁胶将事先固化在玻片表面的疏水层转移到pdms微坑表面，形成超疏水微坑阵列芯片。另一种是基于玻璃基底制备的，该方法通过将微柱模具和硅烷化的玻片对齐后夹紧，向形成的空隙内注入超疏水预聚物后经固化形成微坑阵列芯片。

4、以上两种方法制备得到的超疏水微坑芯片都能避免微坑之间的交叉污染，满足高通量筛选的要求。但是加工过程比较繁琐耗时，而且加工过程中的人为因素很大程度上会影响制备的成功率。例如，制备基于pdms的芯片时，微坑表面的3140胶必须薄而均匀且完整，胶太厚会造成堵孔现象，不均匀不完整的胶会导致转移到芯片上的疏水层不完整，即使附着在微坑表面的胶是薄而均匀且完整的，在转移时要需保证玻片上的疏水层和芯片接触时整个芯片受力均匀，否则转移到芯片的疏水层也是不完整的。而对于另外一种基于玻璃的芯片，在制备时要保证模具的微柱和玻片完全接触，若留有缝隙，在毛细力作用下超疏水预聚物就会进入缝隙，导致微坑底部也形成疏水层，影响后续细胞培养，在组装时还不能夹得太紧以免模具变形或玻片破裂。

5、除了提高药物筛选的通量，提高内涵丰富度也是优化筛药方法的一个重要方面。高内涵筛选以自动化显微镜和图像分析平台为依托，通过超分辨成像和可视化分析深入研究药物的药理作用和剂量关系。传统的超分辨技术往往需要复杂而精密的仪器设备以及经验丰富的技术员进行操作，而且往往需要特定的荧光探针。此外，与普通的荧光显微镜相比，超分辨显微成像系统每单位面积需要分辨更多的像素，由此产生的巨大时间成本使我们在将超分辨技术应用于高通量药物筛选的路上望而却步。

6、膨胀显微成像技术通过在组织或细胞内形成可膨胀的水凝胶网络可实现对细胞内精细结构的物理放大。将细胞中的生物分子和荧光探针共价地锚定到聚合物网络上，待水凝胶在适当浓度的溶液中膨胀后，原本由于其距离小于光学衍射极限而无法分辨的生物分子由于水凝胶的膨胀而拉大了距离，便可以分辨出来，从而仅使用普通荧光显微镜就可实现超分辨率成像。这一过程大大缩短了成像时间，同时保持了高分辨率。膨胀显微成像技术不需要复杂的仪器设备，且使用普通的荧光探针就可成像。此外，即使对于专业知识储备不多的技术人员也比较容易上手，在普通生物实验室就可完成。

7、目前，现有的药物筛选方法往往只能单一地满足高通量或者高内涵的要求。例如，在给定时间内进行药物筛选时，超分辨成像保证了高内涵药物筛选，但其时间成本高，极大地限制了我们能够检测药物的通量。例如单分子定位显微镜的分辨率可以达到20～50nm。但在图像采集过程中会产生大量数据，并且采集时间也很长，anne beghin等人提出了一种基于单分子的自动化定量超分辨率技术，该方法在标准多孔板中操作，结合数据挖掘软件可以很大程度上节省时间。尽管如此，在96孔板中完成图像采集仍然需要8小时。另一方面，若想进行高通量的药物筛选，则只能降低成像分辨率，使用普通荧光显微镜成像降低时间成本，但是由于分辨率降低导致很多亚细胞结构无法被清楚的分辨，我们仅能通过观察细胞的死活来对药物的作用进行评估和研究，这限制了我们对药物药理作用的进一步研究。因此，就目前的筛药方法来看，高通量和高内涵似乎是不能兼容的，这极大地限制了药物筛选的效率，延缓了药物研发的整体进程。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明解决所述技术问题的技术方案是，提供一种高通量、高内涵的药物筛选方法(简称方法)，首先提供一种灵活高效的超疏水微坑阵列芯片的制备方法。所述药物筛选方法通过将所述超疏水微坑阵列芯片与膨胀显微技术结合，实现了高通量，高内涵的药物筛选。与现有技术相比，本发明在同步提高通量和分辨率的同时，还大大降低了时间和材料成本。此外，该方法不需要昂贵的仪器设备和和具有丰富专业技术知识的操作员，在普通生物实验室即可实施和完成。其高效性可大大促进药物的早期筛选，减少新发疾病造成的经济和健康损失。

2、所述高通量、高内涵的药物筛选方法包括以下步骤：

3、步骤1、制备超疏水微坑阵列芯片、多孔状微柱阵列芯片以及图案化树脂芯片；

4、其中所述超疏水微坑阵列芯片的微坑底部为硅烷化的玻璃，除微坑底部以外的表面均为超疏水层；所述多孔状微柱阵列芯片基底为硅烷化的玻璃，其上为多孔状的微柱阵列；所述图案化树脂芯片的基底为硅烷化的玻璃，其上为图案化的树脂凸起结构。

5、优选地，步骤1中，超疏水微坑阵列芯片制备方法包括以下步骤：

6、a1、将两个硅烷化的玻片两侧对齐粘接后，在缝隙中注入光敏树脂；然后利用图案化的光掩模对上述光敏树脂进行光固化，固化完成后清洗掉未固化的光敏树脂，在两个玻片中间形成树脂微柱阵列；

7、优选地，步骤a1中的光敏树脂的配方不受限，可以是任何含有“-c＝c-”的可光固化的光敏树脂。例如，光敏树脂中的单体可以是二缩三丙二醇二丙烯酸酯单体(tpgda)、聚氨酯丙烯酸酯(pua)以及二丙二醇二丙烯酸酯单体(dpgda)等；光敏树脂中的光引发剂可以是任何可引起单体发生光聚合反应的光引发剂，例如可以是二苯基(2，4，6-三甲基苯甲酰基)氧化膦(tpo)以及过氧化苯甲酰(bpo)等。优选地，光敏树脂可以通过在tpgda中加入tpo，然后摇匀，使tpo完全溶解后得到。(tpo用量为3～5％w/v(相对于tpgda))。优选地，tpo的用量为4％w/v(相对于tpgda)。

8、优选地，步骤a1中，清洗掉未固化的光敏树脂的试剂采用无水乙醇或丙酮。

9、a2、将固化后具有超疏水性的含有“-c＝c-”的超疏水预聚物注入到两玻片和树脂微柱阵列产生的空隙中，再利用紫外光对超疏水预聚物进行固化(此时，紫外光的辐照方向与固化光敏树脂时的辐照方向相反)，固化完成后在两玻片和树脂微柱的缝隙中形成超疏水层；

10、优选地，a2中，超疏水预聚物的配方不受限。可选地，超疏水预聚物包含甲基丙烯酸丁酯(bma，20～30％v/v)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(edma，10～20％v/v)、1-癸醇(45～60％v/v)、光引发剂苯基双(2，4，6-三甲基苯甲酰基)氧化膦(i819，1～3％w/v)。

11、进一步优选地，a2中，超疏水预聚物中各成分的含量为23％v/v bma、15％v/vedma、60％v/v 1-癸醇、2％w/v i819。

12、a3、由于固化树光敏树脂和超疏水预聚物时紫外光辐照的方向相反，树脂微柱阵列和超疏水层优先固化在不同的玻片上；将两个玻片从粘接处撬开，两玻片分离后，在一侧的玻片上得到完整的超疏水微坑阵列层，在另一侧玻片上得到树脂微柱阵列。覆盖有超疏水微坑阵列层的玻片即所述超疏水微坑阵列芯片，具有树脂微柱阵列的玻片可直接丢弃。再将超疏水微坑阵列芯片在无水乙醇或丙酮中清洗3次，烘干后备用。

13、优选地，步骤1中，多孔状微柱阵列芯片的制备方法包括以下步骤：

14、b1、将一片硅烷化的玻片和一片粘有不粘膜的玻片两侧对齐粘接，然后在缝隙中注入经光固化可形成多孔状聚合物的预聚物，再利用图案化的光掩模对上述预聚物进行光固化；

15、优选地，b1中，用于制备多孔状聚合物的预聚物的配方不受限，其中聚合单体可以是聚乙二醇二丙烯酸酯(pegda，5～30％w/v)、甲基丙烯酰化明胶(gelma，5～30％w/v)、甲基丙烯酸酐化透明质酸(hama，5～10％w/v)等经光固化可形成多孔状聚合物的聚合单体；光引发剂可以是苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰亚磷酸锂(lap，0.2～0.6％w/v)、2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(i2959，0.2～0.6％w/v)等可以引发光聚合反应的光引发剂。优选地，向超纯水中加入15％w/v pegda和0.5％w/v lap，混匀后得到用于制备多孔状聚合物的预聚物。

16、b2、将两个玻片从粘接处撬开，两玻片分离后，在烷基化的玻片上得到完整的pegda微柱阵列，然后用超纯水清洗掉未固化的预聚物后冻干。

17、优选地，步骤1中，图案化树脂芯片的制备方法包括以下步骤：

18、c1、将一片硅烷化的玻片和一片粘有不粘膜的玻片两侧对齐粘接，然后在缝隙中注入光敏树脂；然后利用图案化的光掩模对上述光敏树脂进行光固化。

19、优选地，步骤c1中的光敏树脂的配方不受限，可以是任何含有“-c＝c-”的可光固化的光敏树脂。例如，光敏树脂中的单体可以是二缩三丙二醇二丙烯酸酯单体(tpgda)、聚氨酯丙烯酸酯(pua)以及二丙二醇二丙烯酸酯单体(dpgda)等；光敏树脂中的光引发剂可以是任何可引起单体发生光聚合反应的光引发剂，例如可以是二苯基(2，4，6-三甲基苯甲酰基)氧化膦(tpo)以及过氧化苯甲酰(bpo)等。优选地，光敏树脂可以通过在tpgda中加入tpo，然后摇匀，使tpo完全溶解后得到。(tpo用量为3～5％w/v(相对于tpgda))。优选地，tpo的用量为4％w/v(相对于tpgda)。

20、c2、将两个玻片从粘接处撬开，在烷基化的玻片上得到图案化的树脂结构，然后清洗掉未固化的光敏树脂。

21、优选地，步骤c2中，清洗掉未固化的光敏树脂的试剂采用无水乙醇或丙酮。

22、优选地，步骤1中，所述硅烷化的玻片的粘接方式不受限制。可选地，用双面胶将其两侧短边对齐粘接，最终得到的微坑深度取决于双面胶的厚度。

23、优选地，步骤1中，图案化的光掩模的形成方式和图案形状均不受限。可选地，可以是圆斑形阵列光，可经数字微镜阵列(dmd)反射产生。

24、优选地，步骤1中，所述微坑阵列芯片的微坑直径为300～2000μm，微坑深度小于500μm和微坑间距大于1000μm；

25、步骤2、对超疏水微坑阵列芯片中微坑底部进行去双健化处理。步骤1制备得到的超疏水微坑阵列芯片中微坑底部为硅烷化的玻璃，其表面有“-c＝c-”官能团，在后续与膨胀显微镜结合时会参与水凝胶交联而使水凝胶无法与微坑底部分离，因此需要对超疏水微坑阵列芯片中微坑底部进行去双健化处理。

26、优选地，步骤2中去双键化处理的方式不受限，可选地，通过用高锰酸钾溶液(0.1～10mg/ml)处理微坑底部进行去双键化处理。包括以下步骤：

27、d1、将固体高锰酸钾溶于水，摇匀，配制高锰酸钾溶液(0.1～10mg/ml)。

28、优选地，d1中，高锰酸钾溶液的浓度为1mg/ml。

29、d2、将高锰酸钾溶液加入到微坑中。

30、优选地，d2中，在微坑中加入高锰酸钾溶液的方式不受限。可选地，使用微量移液枪直接将高锰酸钾溶液加入微坑中；或者将高锰酸钾溶液从超疏水微坑阵列芯片上方(高于5厘米)滴加到超疏水微坑阵列芯片上，直至高锰酸钾溶液覆盖所有微坑。然后去除微坑外超疏水表面多余的高锰酸钾溶液(由于微坑表面的超疏水性，多余的高锰酸钾溶液可以轻易的用吸管吸走)。此时在超疏水微坑阵列芯片中形成高锰酸钾微液滴阵列。

31、d3、高猛酸钾溶液处理微坑底部20～40分钟后，去除微坑中的高锰酸钾溶液。

32、优选地，d3中，使用干燥纸巾吸去微坑中的高锰酸钾溶液，或者直接用超纯水冲洗掉微坑中的高锰酸钾溶液后晾干。

33、步骤3、将细胞接种到超疏水微坑阵列芯片上的每个微坑中进行细胞培养，具体步骤如下：

34、e1、将细胞接种到超疏水微坑阵列芯片的每个微坑中。

35、优选地，e1中，所述超疏水微坑阵列芯片中的细胞接种方式是：通过将整个芯片浸没在细胞悬液中10分钟，待细胞自然沉降到微坑底部后，用移液枪吸去多余的细胞悬液，也可通过用微量移液枪将细胞悬液直接加入到微坑中。

36、e2、将细胞接种到微坑中后，将上述接种有细胞的超疏水微坑阵列芯片放入一个小培养皿中，再一起放入一个较大培养皿中，然后向大培养皿中加入无菌水，以减少微坑中培养基的蒸发。最后将整个装置放入细胞培养箱。

37、e3、根据细胞的生长情况定期更换培养基(每6～12小时更换一次)。

38、优选地，e3中，通过将整个芯片浸没在新鲜培养基中，静置2～10分钟，然后移去多余的培养基，最后放回细胞培养箱。

39、步骤4、当细胞增殖到微坑底部面积的80％时，使用不同浓度的待筛选药物对细胞进行药物处理；

40、优选地，步骤4中，对微坑中的细胞进行药物处理的步骤如下：

41、f1、将不同的药物均匀涂抹到图案化树脂芯片的各个树脂图案区域，在图案化树脂结构表面得到液体药物层。

42、f2、使多孔状微柱阵列芯片中的微柱与液体药物层相接触，实现多孔状微柱阵列中药物的自动加载。

43、f3、将装载有不用药物的多孔状微柱阵列芯片的微柱插入到接种有细胞的超疏水微坑阵列芯片的微坑中，形成微柱-微坑镶嵌结构。此时多孔状微柱中的药物扩散进微坑中，实现药物的并行释放。

44、步骤5、药物处理完成后，应用膨胀显微技术对细胞进行染色和成像观察。

45、优选地，步骤5中，应用膨胀显微技术时进行染色和观察时，步骤如下：

46、g1、固定细胞。

47、优选地，g1中，固定细胞的流程因染色结构而异，均可通过常规的细胞固定流程实现。如，对细胞微管染色时，依次用0.2％v/v的triton x-100、3％v/v多聚甲醛和0.1％v/v戊二醛、0.1％w/v的nabh4、0.5％v/v的triton x-100进行穿透和固定细胞。(上述试剂均用磷酸缓冲盐溶液(pbs)稀释)

48、g2、封闭细胞。

49、优选地，用1％w/v的牛血清白蛋白(bsa，稀释在pbs中)封闭。

50、g3、孵育一抗。

51、优选地，g3中，使用微量移液枪将一抗加入超疏水微坑阵列芯片的每个微坑中，孵育过夜。

52、g4、锚定试剂处理细胞，锚定剂首先与细胞内的蛋白或抗体结合，并且锚定剂带有“-c＝c2-”官能团，在后续水凝胶聚合时可参与交联，将细胞内的蛋白或抗体锚定到水凝胶网络中。

53、优选地，g4中，锚定剂的选择不受限，只需要能与蛋白或抗体结合，并带有“-c＝c-”官能团，可参与水凝胶交联即可。例如，6-((丙烯酰)氨基)己酸琥珀酰亚胺酯(acx)或甲基丙烯酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(ma-nhs)等。

54、优选地，使用0.1mg/ml aex溶液(稀释在pbs中)处理细胞1～4小时。

55、优选地，将整个超疏水微坑阵列芯片浸泡在0.1mg/ml acx溶液(稀释在pbs中)中，反应2小时。

56、g5、添加水凝胶预聚物，发生化学交联。

57、优选地，g5中，水凝胶预聚物的配方不受限制。可选地，所述水凝胶预聚物包含单体、引发剂和催化剂。所述单体由2m氯化钠(nacl)、8.6％～25％w/w丙烯酸钠、2.5％～4％w/w丙烯酰胺、0.04％～0.15％w/w n，n’-亚甲基双丙烯酰胺溶解在pbs中配制而成。向单体溶液中加入0.1～0.2％w/w过硫酸铵(aps，引发剂)和0.1～0.2％w/w n，n，n，n-四甲基乙二胺(temde，催化剂)引发交联反应。

58、优选地，上述水凝胶预聚物中包含2m nacl、8.625％w/w丙烯酸钠、2.5％w/w丙烯酰胺、0.15％w/w n，n′-亚甲基双丙烯酰胺、0.2％w/w aps和0.2％w/w temed，溶解在pbs中。

59、优选地，将上述水凝胶预聚物滴加到所述超疏水微坑阵列芯片上，然后用尺寸匹配的盖玻片轻轻压平后静置于37℃恒温箱使水凝胶预聚物交联成水凝胶。水凝胶交联时间为2～4小时。

60、优选地，使水凝胶预聚物在37℃恒温箱交联3小时。

61、g6、水凝胶交联完成后，使用蛋白酶k均质化。

62、优选地，g6中，蛋白酶k的浓度为5～9units/ml，稀释在消化缓冲液中(50mm tris-hcl，1m nacl，0.5％v/v triton x-100，0.8m盐酸胍，用超纯水稀释)。

63、优选地，g6中，蛋白酶k的浓度为8units/ml。

64、优选地，g6中，将上述表面覆盖水凝胶的超疏水微坑芯片直接浸泡在蛋白酶k溶液中，微坑内水凝胶的膨胀导致微坑侧壁对水凝胶产生挤压，导致水凝胶内部产生应力，促使水凝胶自动与所述超疏水微坑阵列分离，然后将水凝胶转移到干净容器中。

65、g7、带有荧光标记的二抗染色。选择与上述g3中一抗相匹配的，带有荧光标记的二抗进行染色。

66、优选地，g7中，将g6中的水凝胶浸泡在带有荧光标记的二抗(0.5～2％v/v，稀释在pbs中)中进行染色。

67、优选地，g7中，带有荧光标记的二抗浓度为1％v/v，稀释在pbs中。

68、优选地，g7中，二抗染色时间为8～16小时。进一步优选地，二抗染色时间为12小时。

69、g8、清洗未结合的二抗。

70、优选地，将g7中染色后的水凝胶浸泡在pbs中半小时清洗未结合的二抗。清洗3次。

71、g9、水凝胶膨胀。

72、优选地，将g8得到的水凝胶浸泡在低渗透压的溶液中使水凝胶发生均匀膨胀。

73、优选地，使水凝胶发生膨胀的低渗透压的溶液种类不受限。如不同浓度的tris溶液，超纯水等。

74、优选地，将水凝胶浸泡在50mm tris溶液中(用超纯水稀释)2小时。

75、g10、使用激光共聚焦显微镜进行成像。

76、优选地，g10中，使用激光共聚焦显微镜的自动扫描模式对水凝胶中各个染色区域进行自动扫描成像。

77、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

78、(1)描述了一种灵活高效的超疏水微坑阵列芯片的制备方法。

79、相较于之前的技术，所述超疏水微坑阵列芯片通过在两个玻片中间形成树脂微柱，然后注入超疏水预聚物进行固化，由于微柱已经交联在两个玻片中间，玻片和微柱之间没有缝隙，超疏水预聚物不会渗入微坑底部。该方法降低了制备过程中人为因素对制备结果的影响，提高了制备出具有完整图案的超疏水芯片的成功率。

80、相较于之前的技术，在制备所述超疏水微坑阵列芯片时，无需专门制备用于产生微坑阵列的模具，只需要通过绘图软件绘制想要的图案，然后使用相应图案的光掩模进行光固化即可。当需要改变疏水层的几何形状时，只需要通过绘图软件修改即可，无需制备新的模具。该方法提高了制备所述超疏水微坑阵列芯片的灵活性，同时降低了制备成本。

81、(2)描述了一种适用于微阵列的并行的药物释放方法，微坑中的药物释放通过将载药的微柱与微坑中的培养基接触实现，这种并行的药物释放方式大大节约了时间成本，而且不需要使用昂贵且复杂的点样机器人，也不需要专业的大型仪器操作员。

82、(3)在本发明中，在所述超疏水微坑中对细胞进行培养、固定和染色过程都是通过直接将整个芯片浸入所需试剂中，无需逐坑处理。此外，由于微坑芯片的小型化和高集成度的特点，我们只需在所述微坑芯片表面合成一片水凝胶即可对整个芯片所有微坑内的细胞进行成像和分析。在筛选大量药物时，这种并行处理的方式极大地缩短了所需时间，提高了药物筛选的效率。

83、(4)在本发明中，通过使用高锰酸钾溶液处理所述超疏水微坑阵列芯片中微坑底部玻璃，使得微坑底部玻璃上的“-c＝c-”官能团被氧化反应掉，因此水凝胶在发生化学交联时不会与微坑底部的玻璃之间产生共价结合，使得水凝胶可以轻易从微坑中剥离出。解决了超疏水微坑阵列芯片与膨胀显微镜结合时水凝胶无法从超疏水微坑阵列芯片剥离的技术难题。超疏水微坑阵列芯片与膨胀显微镜的成功结合，提供了一种高通量、高内涵的药物筛选方法。

84、与现有技术相比，本发明解决了现有药物筛选方法中高通量与高内涵不能很好地兼容的技术难题，在同步提高通量和分辨率的同时，还大大降低了时间和材料成本。此外，该方法使用激光共聚焦显微镜就可得到高分辨率的荧光图像，相较于传统的超分辨技术，极大地缩短了成像所需时间。而且不需要昂贵的仪器设备和和具有丰富专业技术知识的操作员，在普通生物实验室即可实施和完成。其高效性可大大促进药物的早期筛选，减少新发疾病造成的经济和健康损失。