一种基于微流控囊袋技术的质谱样本前处理方法和应用与流程

本发明涉及质谱分析，具体地，涉及一种基于微流控囊袋技术的质谱样本前处理方法和应用。

背景技术：

1、lc-ms/ms的分析血清中小分子化合物的主要方法之一，液相色谱的分离结合质谱的高特异性检测可以使许多常见的小分子化合物得到准确的定量。在血清样本进行分析之前需要对样本进行前处理，而液液萃取方法和固相萃取法是当前临床质谱检测血清中小分子化合物的主要形式，在萃取过程中因需要用到非极性试剂如正己烷、乙酸乙酯等进行萃取，故而无法直接应用于lc-ms/ms的分析，需要经过氮吹、复溶等较为复杂的实验步骤，才能进行质谱检测，全流程耗时久，对操作人员的要求较高，耗材价格昂贵，同时也不易于实现自动化检测。磁珠固相微萃取方法在处理血清样本方面具有流程简便，试剂成本低，磷脂干扰少，且易于自动化等优势。但是常见的磁珠萃取法在操作过程中需要不断清洗磁珠、收集磁珠、更换试管等操作步骤，使得血清样本在敞开式体系中进行操作，容易造成样本及试剂的挥发和交叉污染等问题。此外，可实现磁珠微萃取法流程的仪器相对设计复杂，耗材损耗量大，尤其地，为了节约成本，采用该方法进行检测时需要集齐8个或16个样本后才进行操作，只适用于大批量的样本检测，而对于少量样本检测具有检测成本高的问题，限制了其使用的范围。

2、基于上述技术问题，本发明在现有技术中磁珠固相微萃取方法的基础上，结合微流控技术，采用流体样本磁珠处理的方法，将血清样本在微囊袋中进行前处理，避免了处理过程中的样本与环境的交叉污染，且整个过程无需更换试管，一次性完成，具有处理方法简单，检测灵活的特点。

技术实现思路

1、基于上述现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于微流控囊袋技术的lc-ms的样本前处理方法，样本处理流程密闭在芯片内进行，不同功能区域的试剂之间无交叉干扰，杜绝了与不同样本和环境之间的交叉污染问题，且全程无需进行试剂和样本的转移，可以实现全自动化的操作，避免了前处理过程中的样品损失。

2、本发明提供了一种基于微流控囊袋技术的lc-ms的样本前处理方法，包括将待处理的样本和试剂集成于微流控囊袋的芯片内的不同功能区中，通过相互挤压不同功能区实现样本的混合处理，完成所述芯片内的磁珠的洗涤、上样、淋洗和洗脱的步骤，实现对样本的前处理。

3、优选地，所述芯片内的功能区至少包括中央室、样本池、淋洗液池、磁珠池、结合液池和洗脱液池；

4、所述样本池与所述磁珠池通过连接微沟道连通；所述中央室与其它各功能区通过阀门连通，通过所述中央室的控制各功能区内的液体进入所述磁珠池内；

5、优选地，所述样本经所述样本池进入所述磁珠池后，经所述中央室的控制，所述磁珠池依次经洗涤液-结合液-淋洗液-洗脱液对样本进行处理，实现对所述样本的前处理。

6、优选地，所述样本的前处理步骤均在所述磁珠池内进行；

7、优选地，所述洗涤步骤包括：将所述淋洗液池中的淋洗液进入所述磁珠池，对所述磁珠池进行洗涤；

8、优选地，所述上样步骤包括：所述磁珠池经洗涤后，所述样本池中的样本、所述结合液池中的结合液分别进入所述磁珠池内，将待测的小分子化合物结合在磁珠上；

9、优选地，所述洗脱步骤包括：再将所述洗脱池内的洗脱液进入所述磁珠池中，将待测的小分子化合物从磁珠上洗脱，洗脱后的洗脱液排出，前处理步骤完成，进入液相色谱中进行分析。

10、优选地，所述淋洗液池包括第一淋洗液池和第二淋洗液池；

11、优选地，所述第一淋洗液池罐装第一淋洗液；所述第二淋洗液池罐装第二淋洗液；

12、优选地，所述洗涤步骤包括一次洗涤步骤和二次洗涤步骤；

13、优选地，所述一次洗涤步骤为所述上样步骤之前进行；所述二次洗涤步骤在所述上样步骤之后进行。

14、优选地，所述二次洗涤步骤在所述上样步骤和所述洗脱步骤之间进行；

15、优选地，经上样步骤后，所述样本与所述磁珠结合后，所述第二淋洗液进入所述磁珠池进行二次洗涤。

16、优选地，所述洗脱池与所述出液口连通；所述洗脱步骤完成后，洗脱液返回所述洗脱池内，经所述出液口排出所述芯片。

17、优选地，所述样本进入所述磁珠池后，各步骤的处理时间分别为：洗涤步骤处理时间为5min；上样步骤的处理时间为13min；淋洗步骤的处理时间为2min；洗脱步骤的处理时间为10min。

18、优选地，所述样本为人体血清样本；待检测的小分子化合物为25羟基维生素d2和25羟基维生素d3。

19、优选地，所述人体血清进入所述样本池前还包括预处理步骤；

20、所述预处理包括在所述人体血清样本加入蛋白沉淀剂后，经过震荡并离心后，去上层清液，即得到预处理后的样本；将所述预处理后的样本罐装至所述样本池内。

21、优选地，所述结合液为含有磁珠的甲醇溶液；所述洗涤液为纯净水；所述淋洗液为20％乙腈溶液；所述洗脱溶液为乙腈和异丙醇体积比为1：1的溶液。

22、优选地，所述蛋白沉淀剂为甲醇溶液。

23、优选地，在添加所述蛋白沉淀剂的同时添加内标化合物，对样本进行定量分析。

24、当对血清样本中的25羟基维生素d2和/或25羟基维生素d3进行分析时，所述内标化合物包括25oh d2-d3和/或25oh d3-d3。

25、优选地，采用本发明的上述的技术方案，也可以对其他小分子化合物进行分析。

26、将上述样本的前处理方法应用于血清样本中其它小分子化合物的定量分析中，仅需要更换结合液，也能够实现相同的技术效果。

27、本发明在磁珠微萃取法的基础上，基于微流控囊袋-流体样本处理芯片装置，将样本处理试剂预先集成于微流控囊袋芯片内，在芯片的不同功能区灌装不同的处理试剂，通过不同控制器之间的导通和相互挤压实现样本的混合处理，完成磁珠的洗涤、上样、淋洗和洗脱的过程。处理后的样本通过lc-ms/ms方法对目标化合物(本发明以25羟基维生素d2和25羟基维生素d3为例)进行分析。整个样本处理的过程密闭在芯片内进行，不同区域的试剂之间无交叉干扰，杜绝了与不同样本和环境之间的交叉污染间题；而且具有检测灵活，随来随检的特点，且能够做到一个样本一个囊袋，避免样本之间的交叉污染。尤其地，微囊袋芯片的制作方式简单，成本低廉，易于大规模化生产，经微囊袋芯片处理后的样本经过lc-ms/ms的精准检测，线性良好，准确度高，具有较大的临床应用价值。

28、本发明技术方案的技术效果：

29、1.通过采用本发明的技术方案，在基于lc-ms技术的基础上，采用微流控囊袋、磁珠法流体样本处理芯片进行血清样品的小分子化合物进行前处理工序，前处理步骤全程在密闭的芯片中一次性完成，无需人工进行样品或试剂的转移，节约了人工操作，也无需与外界环境接触，避免了样本与环境之间的交叉污染问题；区别于现有技术中的磁固相萃取的前处理方法，为lc-ms的前处理提供了新的处理方式。

30、2.通过采用本发明的技术方案，检测灵活，随来随检，且样本前处理时间短，操作过程无需更换试管，样品进入芯片后，十几分钟内即完成全部的前处理工序，且无需添加复溶剂，降低液相色谱的色谱柱使用压力，延长色谱柱的使用寿命，节约成本，尤其地，芯片的制作方式简单，成本低廉，易于大规模化生产。

31、3.本发明采用的技术方案方法简单，对人血清中维生素仅需要采用微流控囊袋、磁珠法流体样本处理芯片进行前处理即可，无需衍生化处理，且样本量需求小，能够结合现实中的各种实际情况，适用于不同类型液相色谱和质谱，对仪器性能要求低，可以基于当前设备的情况进行选择使用，适用范围广，极易推广使用。

32、4.通过采用本发明的技术方案，采用esi电离源即可进行样本检测，灵敏度高，维护频率低，无需更换离子源，可实现对血清中维生素进行准确定量，具有较大的临床应用价值。

33、5.本发明提供的提高灵敏度的分析方法具有前处理简单，该方法线性良好，r＞0.999，血清加标回收率在±15％以内，准确度高；尤其是兼具便于操作、成本低、耗时短、该流程易于实现自动化等优点。