非洲猪瘟病毒间接ELISA检测用样品稀释液、检测试剂盒及方法

本发明属于生物检测，具体涉及一种非洲猪瘟病毒间接elisa检测用样品稀释液、检测试剂盒及方法。

背景技术：

1、非洲猪瘟(asf)是由非洲猪瘟病毒(asfv)引起的一种热性、急性、高接触性传染病，可以感染不同品种和年龄的猪，发病急、病程短，病死率高达100％。

2、目前，非洲猪瘟尚无安全、有效的疫苗上市，防控非洲猪瘟仍需严格的生物安全措施，需要及时诊断疫情并隔离扑杀。因此，开发快速、灵敏、准确的检测方法及检测试剂，对非洲猪瘟的防控具有非常重要的意义。目前，国内外主要的检测技术包括分子生物学检测(pcr、qrt-pcr、lamp、rpa、crispr-amp)和血清学检测(elisa、胶体金免疫层析技术、fat)等，主流产品集中于elisa检测试剂盒和胶体金试纸条。

3、非洲猪瘟病毒基因组长为170-194kb，编码150多种病毒蛋白。而血清学的诊断靶蛋白主要集中在p72、p30、p54、pp62、pp220、cd2v等已经验证其抗原性的蛋白上。例如，中国专利申请cn114088940a(中道生物，国昌生物)公开了一种非洲猪瘟病毒elisa抗体检测试剂盒，以p72、p30和p54蛋白共同作为包被抗原(质量比为1:1:1)，对不同时期抗体均能够有效检出。此外，中国专利申请cn115806631a(山农大)还公开了一种高敏感特异的非洲猪瘟病毒抗体检测方法，以p30-54-72重组蛋白作为包被抗原，该重组蛋白包含p30、p54、p72蛋白上的优势表位区，相较以p30、p54或p72蛋白作为包被蛋白的检测方法具有更高的特异性和敏感性。但是，仍应扩展靶标抗原的选择多样性，优化检测试剂和检测手段，以提高病原抗体检测的特异性和敏感性。

技术实现思路

1、本发明主要解决的技术问题是提供一种非洲猪瘟病毒间接elisa检测用样品稀释液，用于降低样品自身背景的影响，阻断无关抗体的干扰，提高抗体检测的特异性和敏感性。

2、其次，本发明提供一种非洲猪瘟病毒间接elisa检测试剂盒。

3、再次，本发明提供一种非洲猪瘟病毒间接elisa检测方法。

4、为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

5、一种非洲猪瘟病毒间接elisa检测用样品稀释液，所述样品稀释液包含大肠杆菌原核表达蛋白。

6、作为本发明一种优选的实施方案，所述大肠杆菌原核表达蛋白为大肠杆菌经诱导后表达产生的可溶性蛋白，是一种混合物，主要蛋白条带在35kda左右。

7、更优选的，所述大肠杆菌为空载质粒pet-32a转化tssetta(de3)感受态细胞所得的表达菌种，经iptg诱导后破碎取上清，即为大肠杆菌原核表达蛋白。

8、更优选的，所述样品稀释液中大肠杆菌原核表达蛋白的终浓度为10-100μg/ml，优选为50μg/ml。

9、作为本发明一种优选的实施方案，所述样品稀释液还包含酪蛋白。

10、更优选的，所述样品稀释液中酪蛋白的终浓度为1％-10％(w/v)，优选为2％(w/v)。

11、作为本发明一种优选的实施方案，所述样品稀释液还包含缓冲物质，如磷酸盐缓冲物质。

12、更优选的，所述样品稀释液中酪蛋白使用pbs缓冲液溶解。

13、一种非洲猪瘟病毒间接elisa检测试剂盒，所述试剂盒包含所述样品稀释液。

14、作为本发明一种优选的实施方案，所述试剂盒还包含包被抗原，所述包被抗原为s273r蛋白，其氨基酸序列如seq id no：1所示。

15、作为本发明一种优选的实施方案，所述试剂盒还包含酶标二抗、抗原包被液、洗涤液、封闭液、显色液、终止液中的任意一种或多种。

16、更优选的，所述酶标二抗为hrp标记二抗，如hrp-山羊抗鼠igg、hrp-山羊抗猪igg。

17、更优选的，所述抗原包被液为磷酸盐缓冲液，如0.1-0.2m pbs缓冲液，ph值为7.5。

18、更优选的，所述洗涤液为pbst缓冲液。

19、更优选的，所述封闭液为酪蛋白溶液，如1％-10％(w/v)酪蛋白溶液。

20、更优选的，所述显色液为tmb显色液。

21、更优选的，所述终止液为硫酸溶液，如2mol/l硫酸溶液。

22、作为本发明一种优选的实施方案，所述试剂盒还包含asfv阳性血清对照、asfv阴性血清对照中的任意一种或两种。

23、一种非洲猪瘟病毒间接elisa检测方法，包括以下步骤：

24、(1)在含有包被抗原的反应容器中加入用所述样品稀释液稀释的待检样品进行反应；

25、(2)加入酶标二抗进行反应；

26、(3)加入显色液进行显色；

27、(4)加入终止液终止反应；

28、(5)检测od450nm值，判断待检样品中是否存在非洲猪瘟病毒抗体；

29、判断标准如下：

30、待检样品od450nm≥0.295，判定为阳性；

31、待检样品od450nm≤0.258，判定为阴性；

32、0.258＜待检样品od450nm＜0.295，判定为可疑。

33、作为本发明一种优选的实施方案，步骤(1)中，所述包被抗原为s273r蛋白，其氨基酸序列如seq id no：1所示。

34、作为本发明一种优选的实施方案，步骤(1)中，所述含有包被抗原的反应容器为酶标板，其上有包被抗原。

35、更优选的，所述包被以0.2m pbs缓冲液(ph值为7.5)作为抗原包被液，对包被抗原进行稀释，至包被抗原的终浓度为1-8μg/ml，优选为2.5μg/ml。所述包被的温度为37℃，时间为0.5-3h，优选为1h。

36、更优选的，所述包被后进行封闭，封闭以1％-10％(w/v)酪蛋白溶液作为封闭液。所述封闭的温度为30-40℃，时间为0.5-3h，优选在37℃下封闭1h。

37、作为本发明一种优选的实施方案，步骤(1)中，所述待检样品在加入前进行稀释，稀释倍数为1:300-500，优选为1:400。所述加入用所述样品稀释液稀释的待检样品的反应温度为20-40℃，时间为20min-1.5h，优选在37℃下反应1h。

38、作为本发明一种优选的实施方案，步骤(2)中，所述酶标二抗在加入前进行稀释，稀释倍数为1:3000-6000，优选为1:4000。所述加入酶标二抗的反应温度为20-40℃，时间为45-75min，优选在室温下反应1h。

39、作为本发明一种优选的实施方案，步骤(3)中，所述显色的温度为37℃，避光显色的时间为10-20min，优选为15min。

40、本发明的有益效果：

41、本发明提供的非洲猪瘟病毒间接elisa检测用样品稀释液包含大肠杆菌原核表达蛋白(即e.coli蛋白)，其能有效降低待测血清样品自身背景的影响。原核表达蛋白由大肠杆菌制备所得，而临床血清样品中或多或少因有细菌性感染而存在细菌性抗体，所以大肠杆菌原核表达蛋白可以阻断无关抗体的干扰，提高非洲猪瘟病毒抗体检测的特异性和敏感性。

42、本发明提供的非洲猪瘟病毒间接elisa检测试剂盒除包含包被有s273r蛋白(氨基酸序列如seq id no：1所示)的酶标板和样品稀释液外，还包含酶标二抗、洗涤液、封闭液、显色液、终止液、asfv阳性血清对照、阴性血清对照中的一种或多种，可用于检测临床血清样品中是否存在非洲猪瘟病毒抗体。经检验，本发明提供的间接elisa检测试剂盒与商品化试剂盒的符合率高达96.77％，并且，比商品化试剂盒的敏感性高。本发明的试剂盒在4℃下稳定性良好，保存期至少可达60天，检测特异性强、重复性好，可以快速、准确地检测临床血清样品中是否存在非洲猪瘟病毒抗体。