一种验证神经退行性疾病中铁死亡的方法及其应用

本发明涉及生物医药，具体涉及一种验证神经退行性疾病中铁死亡的方法及其应用。

背景技术：

1、神经退行性疾病(neurodegenerativedisease)是人类健康的主要威胁。这类疾病主要包括阿尔茨海默氏病(ad)，帕金森氏病(pd)，亨廷顿病(hd)等，这些疾病在病理生理学上表现是多种多样的，一些会导致记忆和认知障碍，另一些则会影响一个人的运动、说话甚至呼吸的能力。铁死亡(ferroptosis)是一种由谷胱甘肽(gsh)过氧化物酶4(gpx4)控制的细胞内微环境的氧化还原状态失调引起的一种调节性细胞死亡(rcd)，主要表现为较强的氧化应激、膜脂质过氧化以及明显的细胞形态变化。铁和脂质过氧化物为铁死亡过程的主要参与者。大脑由于其高代谢率和相对较低的抗氧化防御能力，易受活性氧(reactiveoxygen species,ros)的影响；且由于脑部富含的膜结构中存在高浓度的多不饱和脂肪酸，使得大脑中的氧化损伤主要表现为脂质过氧化；因此，脑内铁蓄积易导致大量氧化自由基、过氧化物等的产生,从而引起脂质过氧化反应与蛋白质功能上的紊乱,并最终导致神经元的变性、死亡。有研究发现，死亡抑制剂(铁螯合剂和亲脂性抗氧化剂等)可以有效抑制铁死亡过程，也对神经变性和认知衰退具有较好的抑制效果,存在潜在的神经保护能力，为神经退行性疾病的预防和治疗带来了希望。

2、公知的，在疾病治疗药物的研究和开发过程中，需要通过大量的动物实验来验证和确认开发药物对相应疾病的治疗效果，而为了缩短药物开发时间、降低开发成本和准确判断药物治疗机理及疗效，采用药物周期短、可控性好、可重复性高、病理相似度高以及成本低廉的动物实验模板对此具有重要作用。现有技术中，在神经退行性疾病中铁死亡的相关研究中，通常都是利用哺乳动物病理模型(如成年小鼠)作为动物实验模板，然而，哺乳动物病理模型虽然具有可控性好、可重复性高的优点，但也存在药物周期长、成本较高的问题，不利于神经退行性疾病中铁死亡相关研究的大量开展。

3、秀丽隐杆线虫(caenorhabditis elegans，c.elegans)是一种无毒无害、可以独立生存的线虫，因其遗传背景清楚、个体结构简单、生活史短、基因组测序完成等，在遗传与发育生物学、行为与神经生物学、衰老与寿命、人类遗传性疾病、病原体与生物机体的相互作用、药物筛选、动物的应急反应、环境生物学和信号传导等领域得到广泛应用。秀丽隐杆线虫的培养周期以天为单位(哺乳动物一般以月为单位)，且成本低廉、易培养，世代周期短、后代数目多，可同时获得大量背景一致的个体，从而排除了个体差异的影响，保证了实验的重复性和大样本量的实验需求；同时，秀丽隐杆线虫还存在与高等生物在基因和分子通路方面高度保守的优势；因此，将秀丽隐杆线虫作为神经退行性疾病中铁死亡相关研究的动物实验模板，存在理论基础。

技术实现思路

1、针对现有技术中还没有利用秀丽隐杆线虫来验证神经退行性疾病中铁死亡的方法的相关研究，本发明提出了一种验证神经退行性疾病中铁死亡的方法及其应用。

2、为了实现上述目的，本发明提供了一种验证神经退行性疾病中铁死亡的方法，包括至少2个实验方案；所述实验方案为内源性ros含量实验、铁含量实验、内源性脂质过氧化物的含量实验和氧化应激实验；

3、所述内源性活性氧自由基含量实验包括以下步骤：s101、对秀丽隐杆线虫进行针对性培养，收集培养后的秀丽隐杆线；s102、将收集得到的秀丽隐杆线虫在含有二羟乙基吡啶(dhe)的缓冲液中再培养；s103、将再培养后的秀丽隐杆线虫进行固定；s104、利用荧光显微镜拍摄固定后的秀丽隐杆线虫的代表性图像；s105、利用图形处理软件测量代表性图像中反映ros水平的荧光强度，根据荧光强度确定ros的含量；s106、根据ros的含量，评估秀丽隐杆线虫的铁死亡情况；

4、所述铁含量实验包括以下步骤：s201、对秀丽隐杆线虫进行针对性培养，收集培养后的秀丽隐杆线；s202、将收集得到的秀丽隐杆线在含有细胞活性染料(calcein-am)的缓冲液中再培养；s203、将再培养后的秀丽隐杆线虫进行固定；s204、利用荧光显微镜拍摄固定后的秀丽隐杆线虫的代表性图像；s205、利用图形处理软件测量代表性图像中的荧光强度，根据荧光强度确定秀丽隐杆线虫细胞中铁含量情况(荧光强度越大、铁含量越低)；s206、根据秀丽隐杆线虫细胞中铁含量情况，评估秀丽隐杆线虫的铁死亡情况；

5、所述内源性脂质过氧化物的含量实验包括以下步骤：s301、对秀丽隐杆线虫进行针对性培养，收集培养后的秀丽隐杆线；s302、将收集得到的秀丽隐杆线在含有脂质过氧化物探针染料(c11 bodipy 581/591)的缓冲液中再培养；s303、将再培养后的秀丽隐杆线虫进行固定；s304、利用荧光显微镜拍摄固定后的秀丽隐杆线虫的代表性图像；s305、利用图形处理软件测量代表性图像中的荧光强度，根据荧光强度确定秀丽隐杆线虫细胞中内源性脂质过氧化物的含量；s306、根据秀丽隐杆线虫细胞中内源性脂质过氧化物的含量情况，评估秀丽隐杆线虫的铁死亡情况；

6、所述氧化应激实验包括以下步骤：s401、对秀丽隐杆线虫进行神经退行性疾病铁死亡诱导处理，并将诱导后的秀丽隐杆线在含有铁死亡抑制剂的生长培养基(ngm)琼脂平板中进行培养；s402、将培养后的秀丽隐杆线虫进行固定；s403、利用荧光显微镜拍摄固定后的秀丽隐杆线虫的代表性图像；s404、利用图形处理软件定量测量秀丽隐杆线虫中的sod-3:gfp基因和gst-4:gfp基因的表达水平；s405、根据sod-3:gfp基因和gst-4:gfp基因的表达水平，评估秀丽隐杆线虫的铁死亡情况。

7、本发明一种验证神经退行性疾病中铁死亡的方法，其利用秀丽隐杆线虫所具有的相较于哺乳动物更优的诸多生物特性，以及神经退行性疾病铁死亡对秀丽隐杆线虫细胞中特异性蛋白质的表达具有明显影响的机理，针对性的设计了相关的实验方案，方案中利用不同的荧光染色剂对秀丽隐杆线虫细胞中的特异性蛋白质(与铁死亡的情况相关)进行染色处理，能够通过荧光强度的检测快速、准确的得到秀丽隐杆线虫细胞中内源性活性氧自由基含量、铁含量、内源性脂质过氧化物含量以及sod-3:gfp、gst-4:gfp基因表达量，从而能够准确、快速的评估秀丽隐杆线虫的铁死亡情况，进而验证相关药物与神经退行性疾病中铁死亡的利害关系；该方法成本低廉，周期短，可重复性好，能够大规模应用于验证神经退行性疾病中铁死亡的研究实验，对缩短药物开发时间、降低开发成本和准确判断药物治疗机理及疗效具有积极作用。

8、其中，所述的针对性培养是指根据实验目的和实验需要，采用针对性调整(主要是对培养基中的成分进行调整，如添加待测试药剂或不添加铁死亡诱导剂等)后的培养条件对秀丽隐杆线虫进行培养；能更好的体现待测试药物对秀丽隐杆线虫铁死亡的影响关系和程度。

9、其中，所述的固定是指采用化学药剂处理秀丽隐杆线虫，使秀丽隐杆线虫停止生物代谢，从而便于对秀丽隐杆线虫的细胞情况进行观察，得出准确的实验结果。优选的，所述固定时，采用的化学药剂为叠氮化钠或无水硝酸钠。

10、其中，上述实验方案中，所用的缓冲液为线虫m9缓冲液；更适合秀丽隐杆线虫的生长。

11、其中，上述实验方案中，所用的图形处理软件为imagej；能更好的得出荧光强度。

12、其中，上述实验方案中，所述的再培养时间不少于1h；能更好的实现染色效果，荧光效果更明显，检测更准确。

13、其中，上述实验方案中，每组至少分析20只线虫，并重复至少3组实验；使检测结果更准确。

14、其中，优选的，内源性活性氧自由基含量实验中，dhe的用量为每100μl缓冲液中dhe的含量为1-3μl；

15、其中，优选的，铁含量实验中，细胞活性染料的用量为每100μl缓冲液中的含量为2-4μl。

16、其中，优选的，内源性脂质过氧化物的含量实验中，脂质过氧化物探针染料的用量为每100μl缓冲液中含量为1-3μl。

17、为了实现上述目的，进一步的，本发明还提供了一种验证神经退行性疾病中铁死亡方法的应用，用于评估相关药物对神经退行性疾病中铁死亡的治疗效果。

18、优选的，用于评估相关药物对阿尔兹海默病中铁死亡的治疗效果；实验方案包括内源性ros含量实验、铁含量实验、内源性脂质过氧化物的含量实验和氧化应激实验；所述实验方案中，内源性ros含量实验和内源性脂质过氧化物的含量实验中的秀丽隐杆线虫选用cl4176和br5270；氧化应激实验中的秀丽隐杆线虫选用cf1553和cl2166；优选的实验方案和线虫种类，能更好的对阿尔兹海默病中铁死亡的治疗效果进行评估。

19、优选的，用于评估相关药物对亨廷顿病中铁死亡的治疗效果；实验方案包括内源性ros含量实验和内源性脂质过氧化物的含量实验；所述实验方案中，秀丽隐杆线虫选用am141；优选的实验方案和线虫种类，能更好的对亨廷顿病中铁死亡的治疗效果进行评估。

20、优选的，用于评估相关药物对帕金森病中铁死亡的治疗效果；实验方案包括内源性ros含量实验和内源性脂质过氧化物的含量实验；所述实验方案中，秀丽隐杆线虫选用nl5901和bz555；优选的实验方案和线虫种类，能更好的对帕金森病中铁死亡的治疗效果进行评估。

21、综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

22、1、本发明验证神经退行性疾病中铁死亡的方法，利用不同的荧光染色剂对秀丽隐杆线虫细胞中的特异性蛋白质(与铁死亡的情况相关)进行染色处理，能够通过荧光强度的检测快速、准确的得到秀丽隐杆线虫细胞中内源性活性氧自由基含量、铁含量、内源性脂质过氧化物含量以及sod-3:gfp、gst-4:gfp基因表达量，从而能够准确、快速的评估秀丽隐杆线虫的铁死亡情况，进而验证相关药物与神经退行性疾病中铁死亡的利害关系。

23、2、本发明验证神经退行性疾病中铁死亡的方法，成本低廉，周期短，可重复性好，能够大规模应用于验证神经退行性疾病中铁死亡的研究实验，对缩短药物开发时间、降低开发成本和准确判断药物治疗机理及疗效具有积极作用。